IL35基因转染小鼠骨髓间充质干细对小鼠免疫功能的研究.docx

天津医科大学硕士学位论文中文摘 天津医科大学硕士学位论文 中文摘要中又摘要 目的：探讨IL．35基因转染小鼠骨髓间充质干细胞的可行性，及其通过体内和体 外实验对小鼠免疫功能的影响。 方法：(1)利用体外细胞培养技术将Balb／c小鼠的骨髓间充质干细胞自胫骨和 股骨中分离、纯化和培养，在地塞米松，胰岛素，吲哚美辛和3．异丁基．1。甲基 黄嘌呤(IBMX)的作用下进行成脂肪诱导，在地塞米松，B．甘油磷酸钠和维生 素C的作用下进行成骨诱导。流式细胞技术检测所分离和培养的间充质干细胞 的CDl05，CD90，CD44，CD45，CD34，SCA．1情况，对成脂诱导和成骨诱导 的细胞分别进行油红O染色和茜素红染色；(2)IL．35基因表达质粒载体和绿荧 光蛋白表达载体(L6)通过阳离子脂质体转染法对小鼠骨髓充质干细胞进行体 外转染，倒置荧光显微镜观察间充质干细胞绿荧光表达水平，评估细胞转染情 况，流式细胞术(FCM)分析细胞的转染效率，酶联免疫吸附法(ELISA)检测 细胞转染后上清液中IL．35的浓度，分析IL．35基因表达情况； (3)经鼠尾静 脉将IL．35基因转染的间充质干细胞注射于BALB／c小鼠，ELISA检测细胞转染 后血清中IL．35的浓度，流式细胞技术检测转染后小鼠外周血CD3+细胞、CD4+T 细胞、CD8+T细胞、CD4+CD25+Treg比例：(4)分离BALB／c小鼠和C57BL／6 小鼠脾脏单个核细胞，进行单向混合淋巴细胞培养，观察IL．35转染的MSC细 胞对培养体系细胞增殖的影响，以流式细胞技术检测培养体系CD3+细胞、CD4+ T细胞、CD8十T细胞、CD4十CD25十Treg比例。 结果：(1)利用全骨髓贴壁法可成功获得小鼠骨髓间充质干细胞，分离和扩增 后的细胞形态呈长梭型，旋涡状生长，细胞阳性表达CDl05，CD90，CD44和 SCA-1，阴性表达CD45和CD34；第3代间充质干细胞经诱导后可向成脂细胞 和成骨细胞分化。(2)L6体外转染间充质干细胞后倒置荧光显微镜可以观察到 绿荧光蛋白表达，流式细胞术分析MSC细胞的转染效率约27．40％，ELISA可 检测到IL．35转染的MSC细胞上清液中有IL．35的表达；(3)IL．35转染的MSC 经鼠尾静脉注入小鼠后，其血清中可检0H,U至0 IL．35的表达；注入IL．35转染的 天津医科大学硕士学位论文MSC组小鼠外周血CD4+CD25+Treg比例(5．24-1-0．61％)升高，与其他各组组 天津医科大学硕士学位论文 MSC组小鼠外周血CD4+CD25+Treg比例(5．24-1-0．61％)升高，与其他各组组 比较，P0．05，差异具有统计学意义；同时，注入IL．35转染的MSC组小鼠外 周血CD4十T比例(41．72+4．75％)降低，与生理盐水组比较差异有统计学意义 (P0．05)。(4)IL．35转染的MSC细胞能上调同种异体混合淋巴细胞反应体 系中的CD4+CD25+Treg(4．35±O．57％)水平，下调CD3+细胞(29．65±4．44％) 的水平，下调CD4+T细胞(14．47-1-3．86％)水平，与其他各组两两比较差异均 具有统计学意义(PO．05)。 结论：小鼠骨髓问充质干细胞可通过全骨髓贴壁法进行体外分离和培养，间充 质干细胞具有多向分化潜能性，可向成脂肪细胞及成骨细胞分化，并阳性表达 CDl05，CD90，CD44和SCA-1，IL一35转染的MSC能诱导小鼠CD4+CD25+Treg 的增殖和分化，并直接或间接抑制CD3+细胞、CD4+T细胞的活化水平，从而对 免疫移植耐受的建立产生积极的影响。 关键词：IL．35 转染MSC CD4+CD25+调节性T细胞T细胞亚群 AbstractObjective：To Abstract Objective：To investigate the feasibility of IL-35 gene transfection of mice bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs)and the effect of IL一3 5 gene modified MSCs on the immune function of mice． Methods：(1)Harvest the Balb／c mice bone marrow from the tibia and femur,culture mesenchymal stem cells in vitro．Adipogenic differentiation was induced wim dexamethasone，insulin，indomethacin，and IBMX．Osteog