Fucoidan下调HLEC细胞中VEGFR3和PROX1的表达抑制淋巴管新生机制研究.docx

目 目 录 一、摘要 ·1 (一)中文摘要 1 (二)英文摘要 4 二、正文 5 (一)前言 7 (二)材料和方法 ．．． 9 (三)结果 21 (四)讨论 30 (五)结论 34 (六)参考文献 35 三、综述 ．．． ··．40 (一)综述 40 (二)参考文献 48 四、攻读学位期间发表文章情况 56 五、致谢 57 万方数据 大连医科大学硕士学位论文Fucoidan下调HLEC细胞中VEGFR3和PROXl的表达抑制 大连医科大学硕士学位论文 Fucoidan下调HLEC细胞中VEGFR3和PROXl的表达抑制 淋巴管新生及机制研究 硕士研究生：杨亚宗 指导教师： 邹向阳教授 专业名称： 生物化学与分子生物学 摘要 目的：淋巴管新生是肿瘤淋巴道转移的重要过程，抗淋巴管新生和抑制肿瘤 淋巴道转移治疗为有效抑制肿瘤转移的提供可能性。肿瘤淋巴道转移是肿瘤的早 期转移方式也多种肿瘤转移的主要方式，肿瘤细胞侵入淋巴管后，诱导产生调节 因子刺激淋巴管新生，其中淋巴管内皮细胞的增殖，迁移及淋巴管状结构的形成 是淋巴管新生的基本过程。 褐藻多糖硫酸酯(fucoidan)主要是从海洋褐藻中提取，含有丰富的硫酸基团 和L．岩藻糖。与其他褐藻相比，来源于裙带菜(Undaria pinnatifida)孢子叶中的 fucoidan硫酸根含量更高，具有更好的生物活性。Fucoidan是一类很高医药前景的 重点开发的海洋天然药物，具有降血脂、抗凝血、抗肿瘤等多种生物活性。 在淋巴管新生的过程中，淋巴管特异性标志物同源异形盒蛋白(PROXl)与 血管内皮细胞生长因子受体3(VEGFR3)为主要调节因子。同源转录因子PROXl 调控胚胎发育过程中淋巴管系统的发育和分化，维持淋巴管系统形成。激活 VEGFR3及其配体血管内皮生长因子C(VEGF—C)，诱导淋巴管内皮细胞(LECs) 的增殖和迁移，并调节淋巴管新生。NF．r,B／P13K／Akt信号通路主要促进细胞粘附， 增殖，转移和细胞外基质降解，通路上的靶蛋白的激活，对肿瘤的发生和发展具 有促进的作用。 本研究利用实验室前期工作纯化后的fucoidan，以人淋巴内皮细胞HLEC细胞 系为研究对象，采用细胞生物学、分子生物学及动物肿瘤模型探究fucoidan对肿 瘤淋巴管新生的抑制作用，并且深入研究fucoidan抗淋巴管新生的作用机制和相 关信号通路。 万方数据 大连医科大学硕士学位论文方法：1．MTT法检测Fucoidan对HLEC细胞生长活力的影响，fucoidan对HLEC 大连医科大学硕士学位论文 方法：1．MTT法检测Fucoidan对HLEC细胞生长活力的影响，fucoidan对HLEC 细胞周期的作用是通过流式细胞术检测，westernblot检测细胞周期相关蛋白CDK4 和cyclinDl的表达水平。 2．采用Transwell小室法检测fucoidan对HLEC迁移能力，并且利用细胞划痕 实验检测fucoidan对不同时间点HLEC细胞迁移过程的影响。 3．体外实验检测fucoidan对HLEC成管能力的影响。 4．利用细胞骨架检测fucoidan对HLEC细胞骨架结构的影响。 5．细胞免疫荧光技术及RT-PCR方法检测fucoidan对HLEC细胞中VEGFR3 蛋白及mRNA的表达影响，并采用western blot检测VEGFR3及PROXl的表达水 平及NF．r．B／P13K／Akt信号通路的影响。 6．利用Transwell小室共培养方法检测fucoidan对MHCC97H与HLEC共培养 下，HLEC细胞淋巴管状结构形成能力的影响。 7．利用淋巴道高转移Hca．F细胞株建立小鼠肿瘤模型，通过对小鼠肿瘤组织的 双标免疫荧光法检测fucoidan对淋巴管密度(LVD)的影响，并检测小鼠瘤重。 结果：1．MTT法结果说明fucoidan对HLEC细胞活力具有显著的抑制作用， 并随着药物作用的时间，细胞活力呈下降趋势。通过流式细胞术得出结果表明， fucodian通过影响HLEC细胞周期的进程，从而抑制HLEC的增殖能力。Westernblot 实验表明，随fucoidan浓度的增加，逐渐下调cyclinDl和CDK4蛋白表达。 2．Transwell小室法检测结果表明fucoidan处理组迁移的细胞数随药物浓度的 增加而明显减少，并且呈剂量依赖性关系。细胞划痕实验显示随着时间的延长 fucoidan抑制细胞向划痕区域的迁移，并且呈剂量依赖性关系。 3．基质胶成管实验结果显示，fucoidan对HLEC细胞管状结构的形成具有抑制 作用，并显示出剂量依赖性关系。 4．骨架蛋白荧光实验表明，fucoidan处理组中，细胞形态稍皱缩，伪足不明显， 极性较弱，结果说明，fucoi