FTA滤用于基因芯片检测肉中常见食源性致病菌的分析.docx

摘要 摘要 通过不对称PCR技术和基因芯片技术建立了一种准确、快速和高敏感性的检测肉 中常见食源性致病菌的方法。用FTA滤膜从食品样品中直接提取模板DNA。用玻片作 基因芯片的固相载体。选择常见的引起食物中毒的15株菌的16SrDNA基因的一个片 段作为目的基因。设计这段基因的一对通用引物，下游引物用Cy5标记。对两轮不对 称PCR反应体系中退火温度、M92+浓度进行了优化，以确定适宜PCR反应体系和PCR 扩增程序。第一轮适宜反应体系分别为：5uL的10×PCR buffer，0。5uL的20mmol／L dNTP，引物F1、R2各1uL(25umol／L)，O．5uL的Taq酶(2．5u)，含有基因组DNA模板的 滤膜，用去离子水补足到50 uL。循环的条件为：94℃变性5min，从94℃变性30s、 58．8℃退火1 min到72℃延伸30s共25个循环，最后72℃延伸5 min。第二轮适宜反应体 系为：5uL的10×PCR buffer，0．5uL的20 mmol／L dNTP，引物R2 luL(25umol／L)，0．5uL 的Taq酶(2．5u)，第一轮的PCR产物1．5uL，用去离子水补足至lJ50uL。循环的条件为： 94℃变性5 min，从94℃变性30s、55．6℃退火30s至U72℃延，f*30s共30个循环，最后72 ℃延伸5rain。设计二十五条种属的特异性探针，将它们氨基化修饰并点到玻片上，将 不对称PCR的15种扩增产物与制作好的基因芯片杂交，用genepix4对杂交结果进行分 析。 结果表明10株食源性致病菌(金黄色葡萄球菌、肉毒梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭 菌、宋内氏志贺氏菌、霍乱弧菌、普通变形杆菌、拟态弧菌、单核增生李斯特菌、小 肠结肠炎耶尔森氏菌、腊样芽孢杆菌)的检测具有高敏感性和特异性；副溶血性弧 菌的敏感性相对较低；河流弧菌同副溶血性弧菌存在很弱的错杂交，乙型溶血性链球 菌的检测同单核增生李斯特菌和腊样芽孢杆菌存在很弱的错杂交，但是均不影响检测 结果。大肠杆菌0157：H7和沙门氏菌由于同源性非常高，可以通过多重PCR方法检测 出来。整个样品的检测过程耗时6h。本方法检测灵敏度是102CFU／mL。 针对在线BLAST的不足，建立了16SrDNA基因核苷酸序列本地数据库，并在此 基础上进行寡核苷酸探针的本地BLAST以确保其特异性。通过与在线BLAST比较， 本地BLAST在准确性、冗余信息的去除以及使用简便性等方面要优于在线BLAST。 基因芯片相比较其它检测方法有很大的优势，它不仅准确、快速、高效，而且高 通量，可广泛应用于食源性致病菌感染的诊断、应对和控制。 关键词：基因芯片：不对称PCR；检测；肉；致病菌：FTA滤膜 Study Study on DNA microarray detection of common foodborne pathogen in meat sample using FTA filtering technique Author：Zhou Wei Major：Primary product processing and storage engineering Supervisor：Zhang Wei Professor Abstract A accurate rapid and sensitive method for detection for common foodborne pathogenic in food samples was established by using asy—PCR and DNA microarray technology．FTA Filter was used as template preparation for asy—PCR．Glass was used as the array support．A mutation region of the 1 6SrDNA gene Was selected as the discrimination target from 1 5 species of bacteria causing foodborne infections．A pair of universaI primers Was designed for asy．PCR amplification of the 1 6SrDNA gene．The backward primer Was labeled by Cy5．The PCR system was optimized including annealing temperature and the quantities of the