Krüppel样因子8对肝癌细胞干细胞样特性响的研究.docx

Krappel样因子8对肝癌细胞干细胞样特性影响的研究 摘要 研究背景及目的： 肝细胞癌(Hepatocelluar carcinoma，HCC)是在肝脏中最常见的原发性恶性肿 瘤，其发病率在全球癌症中位列第五，同时也是最常见的肿瘤致死原因之一。HCC 的恶性程度极高，由于早期不具有明显的临床症状，许多HCC患者确诊时往往已 处于晚期。现阶段，针对HCC的治疗已取得了较大的进展，可以选择的治疗方式 也相对较多，手术仍然是首选的治疗方式。然而，由于外科手术的低切除率和高复 发率，导致HCC的治疗效果并不十分理想，这迫使人们不得不深入研究其发生、 发展、侵袭和转移过程中的分子机制，以期能进一步开发更有效的早期诊断和治疗 手段。 近年来，随着对肿瘤干细胞(Cancer stem cells，CSCs)研究的不断深入，越来 越多的证据表明肿瘤的异质性与CSCs的分化密切相关。在肿瘤组织中，虽然CSCs 所占比例很少，但已有的研究认为其不仅具有自我更新能力，还具备了多向分化以 及无限增殖的潜力。此外，CSCs在肿瘤的多步骤转移、耐药以及复发过程中发挥 了重要的作用。具有干细胞样特性的肝脏肿瘤细胞即为肝癌干细胞(Liver cancer stem cells，LCSCs)。深入研究LCSCs的调控机制并找到合适的干预靶点有望为HCC 的治疗提供新的思路。 参与多种重要基因转录的K_riippel样转录因子8(Krfippel like factor 8，KLF8) 在HCC发生、增殖和侵袭等恶性生物学行为中起到重要的作用。在既往的研究中， 我们首次发现Wnt／p．catenin途径是KLF8蛋白在HCC细胞中潜在的下游信号通路 之一，Writ／13一catenin在HCC细胞中的活性失调可能与KLF8蛋白高表达直接相关， 因此KLF8蛋白表达水平异常可能与HCC癌变、侵袭和转移有着直接的联系。但 到目前为止，KLF8在干细胞中的研究还很少，其对LCSCs的调控也尚未见报道。 本次研究的目的在于探究KLF8成为新型LCSCs标志物的可能性，并阐明其在 临床用药指征和联合化疗中的价值，为HCC的诊断和治疗提供新的思路。 研究方法： 1．临床资料及样本的收集：收集了80例于2008年3月至2011年10月在我院 行手术治疗的HCC患者的临床资料及肿瘤组织样本。通过检测这些患者肿瘤组织 中KLF8的表达水平并结合所记录的随访资料，分析KLF8的表达与患者预后的关 万方数据  第二军医大学硕士学位论文 系。 2．KLF8对HCC细胞系干细胞样特性的影响分析及机制研究：通过低粘附成球 培养实验富集LCSCs，并通过qRT-PCR检测LCSCs中KLF8的表达情况；使用慢 病毒干扰HCC细胞株中KLF8的表达，然后通过qRT-PCR、流式细胞实验、成球 能力实验等多种方式来探究KLF8干扰后对HCC细胞系干细胞样特性的影响；并 进一步探究KLF8与Wnt／13一catenin信号通路在HCC细胞干细胞样特性调控中的相 互关系。 3．Ⅺ。F8在肝癌细胞耐药中的影响分析：通过流式细胞实验、CCK8实验以及 WB实验检测KLF8低表达HCC细胞系对临床常用药物索拉菲尼和顺珀作用的敏感 性。 实验结果： 1．qRT-PCR检测80例HCC组织及对应癌旁组织中KLF8的rnRNA表达水平， 发现KLF8在76．3％(61／80)HCC组织中的表达量高于癌旁组织：通过WB检测 22例HCC组织及对应癌旁组织，发现81．8％(18／22)的样本中，ⅪJ8在肿瘤组 织中的蛋白表达水平明显高于其癌旁组织；通过qRT-PCR分别检测了40例HCC 患者的肿瘤组织、癌旁组织及门静脉癌栓(Portal vein tunlor thrombus，PVTT)中 KLF8的mRNA表达水平，发现KLF8在PVTT中的表达显著高于HCC及癌旁组 织；通过对80例HCC患者的组织标本及其随访记录进行检测及统计分析，发现 KLF8(+)患者的预后更差。 2．通过低粘附成球培养及qRT-PCR检测，发现KLF8在三种不同的HCC细胞 系(SMMC一7721、MHCC—LM3、Hep G2)成球细胞中的mRNA表达水平明显高于 贴壁细胞；从原代HCC细胞中分离出相应的成球细胞，发现KLF8在HCC患者原 代成球细胞中的mRNA表达水平同样也高于原代贴壁细胞；通过qRT-PCR检测， 发现KLF8在CD24(+)、CD90(+)和EpCAM(+)HCC细胞中的mRNA表达 水平均明显高于CD24(．)、CD90(一)和EpCAM(．)的HCC细胞。 3．通过qRT-PCR检测，发现KLF8被干扰后，两种HCC细胞系(SMMC．7721 和MHCC．LM3)的EpCAM、CD24、C