KIR基因簇KIR3DL KIR2DL1 KIR2DL23多态性研究.docx

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KIR基因簇KIR3DL KIR2DL1 KIR2DL23多态性研究

KIR基因簇KIR3DLl、KIR2DLI、KIR2DL2/3多态性研究 中文摘要 中文摘要 【背景与目的】 供者杀伤细胞免疫球蛋白样受体(ⅪR)基因簇和受者人白细胞抗原(HLA) 不匹配诱导的NK细胞异体反应可改善异基因造血千细胞移植的治疗效果。供者 KIR和受者HLA I类分子发生错配时,KIR抑制基因KIR3DLl、KIR2DLl和 KIR2DL2/3不能阻断NK细胞的细胞毒作用,而表现出异体反应直接杀伤受者的白 血病细胞、T细胞和树突状细胞,进而降低白血病复发率、增加移植物存活率、降 低急性移植物抗宿主病的发生率和严重程度。2002年Rugged等人在(Science)杂 志报道后,陆续有多个血液中心进行类似的报道。 KIR3DLl、KIR2DLl和KIR2DL2/3在基因水平、等位基因水平和受配体系统 都具有及其复杂的多态性。目前国内实验室仅能在基因水平进行研究,尚不能在 等位基因水平开展工作。国际上也仅少数几个实验室能够开展KIR基因DNA编码序 列的分析研究工作,但是其方法仍不十分完善。为此我们在中国和美国乔治城大 学医学部探索KIR3DLl、KIR2DLl和ⅪR2DL2/3可靠的高分辨检测方法,并从基 因水平、等位基因水平和受配体系统三个层面进行系统研究。 【方法】 第一部分90个蒙古族健康人群全血标本采集自内蒙古通辽市科尔沁草原牧 区,提取DNA,以两组不同引物对KIR基因簇进行序列特异性引物聚合酶链反应 (PCR-SSP),同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照,以GH或lB-aetin为内参。 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。对少数两套引物扩增结果不一致的样本使用第三 套引物进行确认。根据扩增的结果计算人群中KIR基因簇各基因的携带率、查询 各个体的基因型、计算观察基因遗传的连锁不平衡现象。收集其他24个人群的相 关数据,统计分析绘制主成分分析散点图和系统进化树。 第二部分100名非裔美国人样本B细胞经EB转染构建细胞株后,常规培养、 提取DNA。设计特异性引物、摸索扩增条件对KIR3DLl和KIR2DLl进行大片段 的扩增和测序。KIR2DL2/3DNA样本扩增前先使用单倍型磁珠分离技术和限制性 中文摘要 KIR基因簇KIR3DLI、KIR2DL!、KIR2DL2/3多态性研究 内切酶进行预处理,去除干扰测序结果的相似基因,再使用特异??引物进行大片 段扩增方法和测序。 第三部分高分辨测定非裔美国人HLA.A、HLA.B和HLA.C的等位基因结果, 根据获得的NMDP编码查询各等位基因是否携带HLA.Bw4抗原决定簇和 HLA.C1、C2的分组。对照KIR3DLl、KIR2DLl和KIR2DL2/3的实验结果分析受 配体系统的多态性。 附录根据KIR3DLl、KIR2DLl和KIR2DL2/3的高分辨结果,对疑似新等位 基因的样本,进行分离。使用等位基因特异性引物扩增、单倍型磁珠分离和PCR 分子克隆技术对等位基因进行分离、扩增和测序,将获得的新等位基因序列向 Genebank和WHO申报,申请新等位基因的命名。 【结果】 l、所有KIR基因均可在蒙古族人群中发现,其中框架基因KIR3DL2、KIR3DL3 携带率为100%。一个样本缺失KIR2DL4基因。KIR2DLl、KIR2DL3、KIR3DLl 携带率分别为93.3%、93.3%和95.6%,KIR2DL2的携带率较低为30.0%。KIR2DL2 的携带率介于蒙古利亚人和高加索人之间。蒙古族人群中37.78%个体的基因型为 从,介于蒙古利亚人和高加索人之间。KIR2DL2和KIR2DS2存在连锁遗传关系, KIR2DL5、KIR2DS 1、KIR2DS3和KII边DS5之间也存在有连锁遗传关系。 2、主成分分析作蒙古族人群和其他24个人群的散点图见高加索人包括欧洲 人、欧裔美国入、阿根廷人、黎巴嫩人及中国的维吾尔族人在散点图中部聚集, 蒙古利亚中的上海汉族、云南汉族、云南彝族、日本人、韩国人及新加坡汉族在 散点图左侧聚集,而蒙古族人群则位于两大人种之间。Physical6.22系统进化软件 包构建系统进化树也发现有类似现象。 3、建立使用相互重叠、可以相互验证的大片段扩增测序方法,获得较满意的 结果。KIR3DLl、KIR2DLl和KIR2DL2/3的测序结果和欧裔美国人的相关研究结 果进行对照研究。非裔美国人中携带KIR3DLl的比例为99%,KIR3DLI*01501 和ⅪR3DLl枣01502是最常见等位基因。l皿鸱DLl·002,*00402,*008,019,和*029 存在于非裔美国人群中,说明了非裔美国人祖先移民美国后,经过数百年历史已 逐步混入了其他种族的KIR

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