Lactobacillus sp.MD1菌乳酸脱氢酶基因的克隆表达及L和D乳酸工程菌的构建.docx

摘要 乳酸(1actic acid)是一种重要的有机酸，特别是近年来，由于可生物降解的聚乳酸 可以解决化学塑料带来“白色”污染，因而乳酸的生产和聚乳酸的合成已成为全世界研 究的热点。乳酸分为D一乳酸、L．乳酸和D，L．乳酸。它们分别由代谢途径中的丙酮酸经过 依赖于NADH的D．乳酸脱氢酶(D—lactate dehydrogenase，D．LDH)和L哥L酸脱氢酶 (L—lactate dehydrogenase，L—LDH)催化形成。因此探讨两种酶及其基因的结构与功能 具有十分重要的意义。 从青贮饲料中筛选出一株高产D，L一乳酸的细菌MD．1。该菌能在48。C、高糖条件下 发酵生产乳酸；酵母粉、麸皮对乳酸发酵影响显著；生物素、对氨基苯甲酸和硫胺素对 菌体生长及产酸有促进作用。在适宜条件下，菌株MD一1利用1509／L葡萄糖72h产生约 1409／L乳酸。 通过对乳酸菌MD．1进行表型和遗传等特征分析，确定MD一1属于乳杆菌属 (Lactobacillus sp．)，但发现该菌在碳源利用、16S rDNA、DNA同源性均和已报道的乳 杆菌存在明显差异，推测可能是乳杆菌属的一个新种。 以菌株MD．1为出发菌株，用乳酸脱氢酶基因(1actate dehydrogenase gene，简称ldh) 和丙酮酸裂解酶基因(pyruvate formate—lyase gene，简称pfl)缺陷的Escherichia coil FMJl44作为宿主，在厌氧条件下，从构建的基因组DNA的随机表达基因文库，通过互 补筛选获得菌株MD一1的D一乳酸脱氢酶基因(鼢D)和L哥L酸脱氢酶基因(1dhL)，将 其在E．coli中进行了表达，并对ldhD和ldhL的结构与功能的关系进行了探讨。 tdhD编码331个氨基酸残基组成的蛋白质，具有典型的依赖于NADH的乳酸脱氢酶 (1dh)特征。分析表明该基因核苷酸和编码的氨基酸序列，与其他菌株的ldhD相似性 极低，相同性和相似性最高分别仅为39％和41。03％。因此，该tdhD是一个新的D．乳酸 脱氢酶基因(D—LDH)。通过在E．coli BL21(DE3)中表达该酶，其大小和预测的结果 一致，具有D．LDH活性，．其比活性达到1．84 U／mg，是对照的50倍。 ldhL编码316个氨基酸残基组成的蛋白质，也具有典型的依赖于NADH的LDH特 征。该ldhL和其他乳杆菌属的膈地基因核苷酸序列和编码的氨基酸序列相似性较低，分 别仪为64．1％和68．9％，是一个新的，抛。在E．coli中表达了预测的ORF编码的蛋白质， 并表现出L．LDH活性，其比活力约为对照菌株的40倍。 通过对L-LDH和D．LDH进行比对，发现，砌￡和，砌D没有明显的相似性，其进化 距离很远，属于完全不同的脱氢酶家族。 通过嵌合PCR分别构建了失活的ldhL和ldhD。采用基因敲除方法分别获得了ldhD 失活的菌株IMD3082和ldhL失活的菌株IML3082，它们分别发酵产生L碍L酸和D{L酸， 其光学纯度可以达到97％以上，可用于L．乳酸或D哥L酸的生产。 关键词：乳杆菌(Lactobacillus sp．)MD．1，乳酸发酵，基因文库，D．乳酸脱氢酶基因， L一乳酸脱氢酶基因，基因克隆与表达，工程菌株  Abstract Lactic acid was a very important organic acid．Especially in recent years，polylactic acid which could be used in biodegradation could resolve the white pollution brought by plastic．So the production of lactic acid and the synthesis of polylactic acid have become the hotspurs in the world—wide research region．Its enantiomeric purity is important to its application．Lactic acid comprised D—lactic acid，L—lactic acid and D，L—lactic acid．They were respectively compounded from pyruvic acid by the Catalysis of D—lactate dehydrogenase and L—lactate dehydrogenasc in the metabolic pathway，Therefore，studies of t