LAMP和PCR检测单核细胞增生性李斯特菌的分析.docx

摘要单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria 摘要 单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)简称单增李斯特，它是一 种能够引起人畜共患的食源性致病菌，属李斯特菌属。它在自然界中分布广泛，如 土壤、腐败的蔬菜及多种食品中。食用了被单增李斯特污染的食物后可以引起“李 氏杆菌病”，使人和动物患脑膜炎、败血症、流产等，死亡率可达20％--30％。该菌 主要侵袭孕妇、新生儿、老年人和免疫力低的人群。近年来由该菌引起的食物中毒 事件越来越多，引起了人们的广泛关注。传统的检测单增李斯特的方法操作繁琐、 检测时间较长，通常需要5~7d才能完成且灵敏度较低。不能满足食品中致病菌快 速、灵敏的检测需要。因此需要建立快速、灵敏的单增李斯特的检验方法。 目前，快速检测单增李斯特的方法报道最多的是应用PCR方法。环介导等温扩 增技术(Loop．mediated isothermal amplification，简称LAMP)是2000年由同本的 荣研株式会独自开发出来的一种新的核酸扩增方法。它是针对靶基因的6个区域设 计4种特异的引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bsr DNApolymerase)在恒温条 件(65℃左右)下进行扩增。可以在1h之内，将靶DNA片段扩增10‰1010倍。 本研究以单增李斯特的李氏溶血素基因(办咖)为靶基因，选择特异性引物进行 PCR扩增，同时成功设计了LAMP引物进行LAMP反应，并与PCR进行比较。 对PCR反应体系中镁离子浓度、退火温度和循环数等PCR影响要素进行优化， 以确定适宜PCR反应体系和PCR扩增程序。PCR反应的总反应体系为50此，其中 含有5此10xPCR buffer，4此dNTPs混合物，2此10}tmol／L上游引物，21．tL 10斗mol／ L下游引物，41xL氯化镁，0．5此(5U／I．tL)Taq DNA聚合酶，32．51xL ddH20；PCR 扩增程序为：PCR反应采用冷启动，94℃预变性4 rain，再按94℃变性45s一--60℃ 退火30 s～72℃延伸45s进行35个循环，最后72℃再延伸5 rain。PCR反应产物在 2％的琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统观察结果，产生预期大小的片段 (702bp)。 基于单增李斯特的hty基因利用官方设计软件设计出LAMP反应的外引物F3、 B3和内引物FIP、BIP。并对反应时间、反应温度、镁离子浓度、内外引物浓度比 等扩增条件进行优化。LAMP反应的总反应体系为25此，其中含有0．81工mol／L的 FIP和BIP，0．2I，tmol／L的F3和B3，400btmol／L的每种dNTP，lmol／L的甜菜碱， 20mM Tris-HCl(pH8．8)，10mM KCl，10mM(NH4)2S04，4 mM MgS04，0．1％ Triton．100和一定量的模版DNA。将反应混合物在95℃加热5min后放置冰上冷却， 然后加入8 U的Bst DNA聚合酶大片段，在63℃孵育60min，然后在80℃加热 10min终止反应。LAMP反应产物在2％的琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统 观察结果，产生预期的梯形条带。对12株菌分别进行了PCR反应和LAMP反应来 验证引物的特异性，结果表明：单增李斯特均为阳性结果，其它菌株均为阴性结果。 采用FTA滤膜制各模板进行PCR和LAMP反应，其方法的灵敏度分别为 1．4x102CFU／mL和7．3x10CFU／mL。利用PCR技术和LAMP技术直接检测人工污染 的鸡肉中的单增李斯特，检出限分别为9．6x102CFU／g和8．9x10CFU／g。 通过两种方法的比较，可知LAMP比PCR更快速、灵敏。有着更为广泛的发 展前景。通过本课题的研究，为单增李斯特氏菌的快速检验构建了一个新的技术平 台。 关键词：PCR；环介导等温扩增技术；单核细胞增生李斯特氏菌；检测；FTA滤膜 The The Study on the Detection of Listeria monocytogenes by LAMP and PCR Author：Zbang Ya Shuang Major：Microbiology Supervior：Zhang Wei Abstract Listeria monocytogenes，belonging to Listeria genus，is a Idnd of food-borne pathogenic bacteria which can cause human and animal diseases．It is widely distributed in the environment，where its primar