M.smeg2395基因反义下表达对耻垢分枝杆菌生长影响的研究.docx

目 目 录 一．摘要 。1 (一)中文摘要 1 (二)英文摘要 4 二．正文 7 (一)前言(一)日U舌 ．‘77 (二)材料与方法 lO 1．材料 ．10 1．1质粒与菌种 10 1．2主要试剂 ．1 1 1．3主要仪器 ．1 1 2．实验方法 1 1 2．1结核分枝杆菌Rv2981c基因的过表达及D．丙氨酰一D．丙 氨酸连接酶活性的鉴定 11 2．1．1Tb一谢从基因的PCR扩增 ．．11 2．1．2pMDl 8．Tb—ddlA克隆质粒的构建 ．．1 3 2．1．3pColdII．Tb—ddlA表达质粒的构建 1 5 2．1．4结核分枝杆菌DdlA蛋白在大肠杆菌中诱导表 达 l 6 2．1．5结核分枝杆菌DdlA蛋白的鉴定 ．．17 2．1．6DdlA蛋白的D一丙氨酰．D．丙氨酸连接酶活性鉴 定 ．．19 万方数据 2．1．7DdlA蛋白的多克隆抗体的制备与检测 2．1．7DdlA蛋白的多克隆抗体的制备与检测 20 2．2耻垢分枝杆菌pMind-Sm-ddlA—As反义下调表达菌株模 型的建立及对生长影响分析 21 2．2．1目的基因Sm．ddlA．AS的的PCR扩增 ．21 2．2．2pJET．Sm—ddlA．AS克隆质粒的构建 ．．22 2．2．3pMind．Sm一谢从．AS表达载体的构建 ．23 2．2．4耻垢分枝杆菌ddlA基因的反义下调表达模型的建 立 25 2．2．5强力霉素对Sm—ddlA基因反义RNA表达菌株模型 的验证 ．．26 2．2．6Sm—ddlA基因表达下调对耻垢分枝杆菌的形态影 响 27 (三)结果 28 3．1结核分枝杆菌Rv2981c基因的表达及D．丙氨酰．D．丙氨酸 连接酶活性的鉴定 28 3．1．1Tb—ddIA基因的PCR扩增 ．28 3．1．2pMDl8-Tb—ddlA克隆质粒的构建 ．．28 3．1．3pColdII—Tb—ddlA表达质粒的构建 30 3．1．4Tb．DdlA蛋白的诱导表达 ．30 3．1．5DdlA蛋白的D．丙氨酰．D．丙氨酸连接酶活性鉴定 30 3．1．6DdlA蛋白多克隆抗体的制备与效价确定 ．33 3．2耻垢分枝杆菌pMind．Sm．ddlA．As反义下调表达菌株模型的 万方数据 生长及形态影响的分析 生长及形态影响的分析 34 3．2．1目的基因Sm．ddlA．AS的的PCR扩增 ．．34 3．2．2pJET-Sm一蒯纠．AS克隆质粒的构建 35 3．2．3pMind—Sm一以班一AS表达载体的构建 ．35 3．2．4耻垢分枝杆菌Sm—ddlA反义RNA菌株的下调诱导效 果的检测 36 3．2．4．1耻垢分枝杆菌Sm—ddlA反义RNA的诱导表达效 果 ．．36 3．2．4．2耻垢分枝杆菌Sm—ddlA反义RNA的诱导效果的 检测 ．37 3．2．5透射电镜观察耻垢分枝杆菌Sm—ddlA反义RNA的诱 导表达对细菌形态的影响 38 (四)讨论 39 (五)结论 41 (六)参考文献 42 三．综述 ．44 (一)综述 44 (二)参考文献 51 四．致谢 54 万方数据 大连医科大学硕士学位论文M．smeg-2395基因反义下调表达对耻垢分枝杆菌 大连医科大学硕士学位论文 M．smeg-2395基因反义下调表达对耻垢分枝杆菌 生长影响的研究 硕士生姓名：周 顺 指导老师：张文利 副教授 指导小组：马郁芳教授 专业名称：生物化学与分子生物学 摘要 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，M．rb)是引起结核病(Tuberculosis， TB)的病原体。目前结核病的防治形势依然严峻。201 5 WHO统计报告指出，2014 年的结核病新增病例超过960万，死亡病例达150万，呈增加趋势。这主要是由于 结核病的传播途径为空气的飞沫传播，易于传染；此外，近年出现了多重耐药性 及极度耐药性丝乃菌株的感染，使对结核病患者的治疗困难。因此要治愈结核病， 克服耐药的M乃感染，有必要寻找有效的抗结核新药或新的药物靶点。 M乃细胞壁结构特殊，对分枝杆菌的生存和繁殖极为重要，因而影响细胞壁完 整性的因素，常为寻找和设计抗结核新药的理想靶点。分枝杆菌细胞壁核心结构 为mAGP(Mycolic acid—Arabinogalactan．Peptidoglycan)，是由分枝菌酸、聚阿拉伯 半乳糖和肽聚糖三种组分共价连接形成。肽聚糖是其中重要的组成成分，其完整 性影响细菌的增殖和生存。 本文研究的靶向分子DdlA(D一丙氨酰一D一丙氨酸连接酶)为影响肽聚糖生物合 成过程中的供体D一丙氨酰．D．丙氨酸的供给。D．丙氨酰．D．丙氨酸是以D．丙氨酸为 原料，由Dd认催化形成的。因此选取M乃基因组中的ddlA基因(Rv2981c)作为