micoRNA调控COPD大鼠肺泡巨噬细胞TLR2受体表达的作用机制研究-内科学（呼吸系病）专业毕业论文.docx

博士学位论文泡巨噬细胞miRNAs表达差异。 博士学位论文 泡巨噬细胞miRNAs表达差异。 结果：模型组胸部CT、肺功能、肺病理均符合COPD表现。肺泡巨噬细胞瑞氏 染色见细胞呈圆形或椭圆形，核大深染。CD68行免疫荧光染色见肺泡巨噬细胞 荧光染色呈阳性。与对照组相比，模型组let．7b．3p与miR-675—5p显著下调； miR-200b-3p、miR-665、miR-344b一1-3p、miR一34c一5p、miR一34b一5p、miR一99b-5p、 miR一129-1—3p、miR一3557—5p、miR一33l一5p、miR-493—5p、miR一200a一3pl】种miRNAs 显著上调。 结论：1．单纯烟熏法能成功复制COPD大鼠模型：2．COPD大鼠肺泡巨噬细胞与 正常对照组之间存在明显差异的miRNA表达。其中11个miRNA表达上调，2 个miRNA表达下调。需要做进一步研究来探索其功能。 关键词：肺疾病阻塞性慢性微小RNA大鼠 第二章 调控COPD大鼠肺泡巨噬细胞TLR2受体表达的miRNA 预测 目的：筛查调控COPD大鼠肺泡巨噬细胞TLR2受体表达的miRNA。 方法：采用mirbase，miranda和mirdb三个数据库，分别对第一章获得的13个 miRNA进行靶基因预测，评估获得的靶基因是否有TLR2。其次通过生物信息 学方法为TLR2反向预测所有相关miRNA，最后通过NCBI网站检索与TLR2 相关的miRNA文献。将后两者结果与芯片发现的所有miRNA(含无统计学差 异的miRNA)进行比对。采用以上三种途径获得调控COPD大鼠肺泡巨噬细胞 TLR2受体的所有miRNA。最后为排除基因芯片假阳性或假阴性可能，采用实 时荧光定量PCR(QPCR)的方法对其进行验证，并对最后筛选的阳性结果，利 用DAVID6．7系统进行靶基因Gene ontology(GO)／及KEGG pathway分析。 结果：采用mirbase，miranda和mirdb三个数据库进行靶基因预测，共计表达12368 个靶基因。仅miRDB数据库预测miR-344b．1．3P的靶基因为TLR2。采用miRWalk Ill 万方数据 摘要数据库，反向预测与TLR2基因有序列互补关系的miRNA，共找到13个miRNA， 摘要 数据库，反向预测与TLR2基因有序列互补关系的miRNA，共找到13个miRNA， 再将其与芯片发现的所有miRNA进行比对，结果提示Rno—miR一124-3 P， mo。miR一363．5Erno—miR一9a一3p在芯片中有表达。经NCBI检索，发现miR一125， miR-19a／b．miR．146a的靶基因为TLR2。再将其与芯片发现的所有miRNA进行 比对，结果提示mo-miR．125b．5p、rno．miR一19b．3p、miR-146a一5p在芯片中有表 达。扩大样本量，对经以上三种方式发现的与TLR2相关的的7个miRNA进行 qPCR验证。7个miRNA中mo—miR344b-1-3p、mo—miR-125b一5p、miR一146a-5p 差异有统计学意义。7个miRNA芯片与qPCR表达趋势一致。miR-344b一1—3p表 达在芯片及qPCR结果中表达均上调且均有统计学差异，为首次报道。靶基因 KEGG信号通路富集分析表明，miR。344b．1．3p的靶基因与TLR信号通路有关。 结论：1．实时荧光定量PCR结果与芯片结果一致，基因芯片结果可靠；2．筛选 miR．344b．1．3p调控COPD大鼠肺泡巨噬细胞TLR2受体表达；3．miR．344b．1．3p 靶基因pathway分析可见与TLR信号通路有关。 关键词：实时荧光定量PCR微小RNA大鼠 第三章双荧光素酶双报告系统验证miR．344b一1．3p对肺泡巨噬细 胞TLR2受体表达的调控 目的：验证miR．344b．1．3p是否直接作用于TLR2．3‘UTR。 方法：通过在线分析软件对TLR2基因的miR．344b．1—3p结合位点做生物信息学 分析，通过长引物序列拼接及点突变合成全序列TLR2．3’UTR。目的基因TLR2- 3 7UTR分别被正向及反向亚克隆至海肾萤光素酶翻译终止密码子下游多克隆位 点，构建含有TLR2．3 7UTR区域融合报告基因质粒，并进行重组质粒测序鉴定。 将质粒转染至293细胞进行双荧光素酶活性检测。 结果：成功构建含TLR2．3 7UTR区重组质粒。双荧光素酶报告系统检测提示与 IV 万方数据 博士学位论文mimics对照组相比较，过表达的miRNA344b一1-3p 博士学位论文 mimics对照组相比较，过表达的miRNA344b一1-3p mimics可显著降低 T