GLP审审1及其类似物对HepG2细胞异生作用的影响及机制探——PI3K通路.docx

天津医科大学 硕士学位论文 GLP-1及其类似物对HepG2细胞异生作用的影响及机制探讨-- PI3K通路 姓名：于海雁 申请学位级别：硕士 专业：临床医学；内科学内分泌与代谢病 指导教师：谢云 201105 天津医科大学硕士学位论文中文摘要 天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 目的： 1．体外培养人肝肿瘤细胞HepG2细胞系。 2．研究胰高血糖素样肽一l(glucagon—like peptide．1，GLP一1)及其类似物Exendin-4 对HepG2细胞糖异生作用的影响并探讨其作用机制一P13K(phosphatidylinositol 3 kinase)通路。 3．为GLP．1及其类似物有效的降糖、更有针对性地改善糖代谢，为临床治疗提 供初步的理论依据。 方法： 1．体外培养人肝肿瘤细胞HepG2细胞系，通过倒置显微镜形态学观察。 2．将培养的HepG2细胞随机分为4个干预组，每组五个样本，四组分别为Control 组，insulin(INS)(10nmol／L)干预组，GLP一1(10nmol／L)干预组，Exendin-4(10nmol／L) 干预组，各组的五个样本分别干预0h，4h，8h，16h，24h五个时间点，提取细胞总蛋 白，检测磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Phosphoenol pyruvate earboxy kinase，PEPCK) 的蛋白表达量，描绘出PEPCK表达随时间变化的趋势曲线，选取合适的药物干 预时间，作为药物的最终干预时间。 3．将培养的HepG2细胞随机分为9组：(i)Control组，(室)INS(1 0nmol／L)组，③GLP —l(1 0nmol／L)组，@Exendin-4(1 0nmol／L)组，⑤GLP一1(1 0nmol／L)+iNS(1 0nmol／L) 组，(查)Exendin-4(1 0nmol／L)+iNS(1 0nmol／L)组，(DLY294002(1 5lmaol／L)组，⑧ GLP-1(10nmol／L)+LY294002(15“mol／L)组，(_9)Exendin-4(10nmol／L)+LY294002 (15肛mol／L)组，分别干预上述时间后，用蛋白质印迹(westernblot)法测定各组PE PCK蛋白的表达量。 多士申．当日木- 1．人肝肿瘤细胞HepG2细胞系的传代培养情况良好。 2．各实验组INSOOnmotCL)组，GLP．100nmoVL)组，Exendin-4(10nmol／L)组， GLP一1(10nmol／L)+iNS(10nmol／L)组，Exendin-4(10nmol／L)+INS(10nmol／L)组， LY294002(15panol／L)组，GLP一1(10nmol／L)+LY294002(15panol／L)组，Exendin一4 (10nmol／L)+LY294002(15rtmol／L)组，与对照组相比，HepG2细胞的形态未见明 天津医科大学硕士学位论文显改变，药物干预24h内对照组与各药物干预组细胞形态完好。 天津医科大学硕士学位论文 显改变，药物干预24h内对照组与各药物干预组细胞形态完好。 3．蛋白印记法测对照组及各药物干预组在不同时间点的PEPCK表达量，发现 Control组，4hPEPCK蛋白表达明显上升，16h后曲线变化趋于平稳；INS、GLP．1、 Exendin-4组在8hPEPCK的蛋白表达量与同组4h比较明显减少，8h后PEPCK 蛋白表达曲线趋于平稳，变化幅度不明显，故选取8h作为药物最佳干预时间。 4．对照组以及8个实验组在不同药物以一定浓度干预8h后western blot结果表 明： (1)与Control组相比，GLP．1组O Onmol／L)、INS组(1 Onmol／L)、Exendin-4 (10nmol／L)组的PEPCK的表达量均明显减少仞O．05)，表明INS、GLP．1、Exendin- -4能降低HepG2细胞中PEPCK的蛋白表达量； (2)与INS(10nmol／L)组相比，GLP—l(10nmol／L)+INS(10nmol／L)组、Exendin． ．．4(10nmol／L)+iNS(10nmol／L)组中PEPCK的蛋白表达量均明显减少@0．05)；表 明GLP．1、Exendin-4分别与玳S联合组对PEPCK蛋白表达的抑制有一定的叠 加作用； (3)与Control组相比，LY294002(15pmol／L)组PEPCK的蛋白表达量无明显 差异pO．05)，表明P13K阻断剂LY294002单独应用对HepG2细胞中PEPCK的 蛋白表达无明显影响；与GLP．1(10nmol／L)组相比，GLP一1(10nmol／L)+LY294002