miR1011和miR318在DNA损伤应的功能.docx

目 目 录 一、摘要 ．1 (一)中文摘要 ．1 (二)英文摘要 ．3 二、正文 ．5 (一)前言 5 (二)材料和方法 6 1．材料 ．．6 1．1果蝇品系 6 1．2质粒 ．6 1-3实验试剂 6 1．4主要仪器 8 1．5主要软件 9 2．方法 9 2．1果蝇食物配制及培养 一9 2．2 LB液体培养基及LB平板配制 10 2．3 miRNAsgRNA质粒构建 10 2．4 miRNAs转基因质粒构建 ．．14 2．5离子辐射敏感性检测 16 2．6 BrdU掺入实验 16 2．7 G2／M细胞周期检查点检测 ．．17 万方数据 2．8实验数据统计学分析 2．8实验数据统计学分析 ．．17 (三)结果 18 1．miRNAsgRNA和miRNAs转基因质粒的构建 18 1．I miRNAsgRNA质粒构建 18 1．2 miRNAs转基因质粒构建 20 2．mir一1011、mir．318、mir．278、mir一8、mir一932、 mir一274、mir一9c、 mir．375突变体对DNA损伤敏感性检测 ．．22 2．1 mir．101I、mir一318、mir-278、mir一8突变对Y．辐照敏感 22 3．miR．1011初miR一318参与DNA损伤应答的机制研究 ．．24 3．1 miR一1011初miR一318突变对G1／s细胞周期检验点的影响 24 3．2 miR一1011 fffmiR一318突变对G2／M细胞周期检验点的影响 26 (四)讨论 。。27 (五)结论 31 (六)参考文献 ．．32 三、综述 36 (一)综述 36 (二)参考文献 4l 四、致谢 ．45 万方数据 大连医科大学硕士学位论文miR-1011和miR-318在DNA损伤应答的功能 大连医科大学硕士学位论文 miR-1011和miR-318在DNA损伤应答的功能 硕士研究生：方龙 指导教师：秘晓林 专业名称：病理学与病理生理学 摘要 基因组的稳定性不断地被DNA损伤挑战，每天每个细胞遭受数十万次DNA 损伤事件。这些DNA损伤事件由正常细胞代谢废物或者DNA复制压力导致，也 可以由辐射和环境中化学毒物导致。在淋巴细胞和生殖细胞，DNA损伤也可能 由基因组重排引起。DNA损伤可以干预DNA复制和转录，并导致基因突变和染 色体断裂紊乱。DNA损伤应答系统维持着基因组的稳定性，消除DNA损伤的不 利结果，阻止它们向子代细胞传递。DNA损伤应答系统的缺陷将导致衰老和各 种紊乱包括发育缺陷、退行性神经性疾病和肿瘤的发生。因此，一个有效的DNA 损伤应答系统对于细胞和有机体的生存是非常重要的。 miRNA是一种大小约1 8bp～22bp、非编码RNA分子。miRNA主要通过结合靶 基因mRNA 3’UTR区域的miRNA结合元件来调节靶基因转录后水平，其调节靶基 因转录后沉默通过同源mRNA的特异性切割或者特异性抑制蛋白质合成两种方 式。近来研究鉴定出了卅fRM成熟所必需的多种亚单位蛋白复合体并将其命名为 微处理器。微处理器包括：Drosha、RNase 1II核酸内切酶和DGCR8。据预测在 人类大约有2000个miRNA，超过900个miRNA已经被证实，调节人类30％的基因。 miRNA除了在正常发育和细胞生理过程中发挥着重要的功能，随着研究发现 miRNA功能的紊乱有助于人类疾病的发生，其紊乱可以导致神经退行性疾病、肿 瘤、心脑血管疾病等一系列疾病的发生。DNA损伤时DNA损伤应答基因在转录 水平和转录后水平被调节。miRNA作为一个非编码RNA，在DNA损伤时也可以 转录和转录后水平被调节。 目的： 有大量研究已经在体外对DNA损伤时miRNA的功能进行了研究。然而，在果 万方数据 大连医科大学硕士学位论文蝇体内miRNA对DNA损伤反应还缺乏系统性研究。本研究以果蝇为模型，初步分 大连医科大学硕士学位论文 蝇体内miRNA对DNA损伤反应还缺乏系统性研究。本研究以果蝇为模型，初步分 析了miRNA在DNA损伤应答中的功能。 方法： l本实验室前期实验人员通过RNA—seq方式筛选出了46个p53依赖性和非依 赖性差异表达的miRNAs。 2利用分子克隆技术构建-jYmiRNAs gRNA质粒和miRNAs转基因质粒。 3通过离子辐照敏感性实验，研究-Jmir一1011、mir一318、mir一278、mir-8、 mir．932、mir．274、mir一9c、mir一375果蝇突变体对DNA损伤敏感性检测。 4通过BrdU染色实验，检测了埘识．1011和miR一318突变对GI／S细胞周期检验 点的影响。 5通过PH3染色实验，检测了miR．1011和miR．318突变对G2／M细胞周期检验点 的影响。 结论： l本实验