miR12 miR319 miR393 miR402的功能分析及转化木薯.docx

l l YII I I 1I 19I I 13I 113111111311 lU0111Y1 933307 海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。 除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人 承担。 论文作者签名：叶可奏 日期：”11年f月9 El 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海南大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和 汇编本学位论文．本人在导师指导下完成的论文成果，知识产权归属海南大学． 必威体育官网网址论文在解密后遵守此规定。 论文作者签名：叶酉蠹 导师签名： 日期：≯o l 1年}月留El 日期：三口lf 日 本人已经认真阅读“CALLS高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论文提交 “CALIS高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中规定享受相关权益。国壶途奎 握銮卮澄唇；旦坐生；旦=生i畦生苤查。 导师签名： 日期：：zoll 日 摘 摘 要 MicroRNA(miRNA)是生物体内普遍存在的一种内源、非编码、小分子量的单链 RNA分子，其前体具有茎．环结构。具有高度保守性、时序性和组织特异性。成熟miRNA 通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对，在转录后水平介导靶mRNA降解或翻译抑制 来调控基因表达。相对动物而言，植物miRNA的研究起步较晚，但由于miRNA研究 技术的不断发展，新发现的植物miRNA的数量呈倍数增长。2010年9月份miRbase数 据库释放了Releasel6．0版本，公布3070个植物miRNA，其中双子叶植物1769个miRNA， 单子叶植物887个miRNA。到目前为止，对植物miRNA的研究主要集中在基因组已被 解析的拟南芥、水稻等模式植物上，而很少对非模式植物的miRNA进行研究，在miRbase 数据库中还没有木薯miRNA的相关信息。本研究分析了GenBank中已公布的拟南芥中 miR319、393、402和miRl72的功能，将鉴定具有提高植物耐寒性功能的miRNAs转 入木薯，在此基础上进一步从木薯中分离了与耐寒相关的miRNAs，结果如下： l、从拟南芥中分离了miR319e、393b、402和miRl72e，并通过生物信息学预测了miRl72c 的20个靶基因，miR319c的14个靶基因，miR393b的8个靶基因，miR402的2个 靶基因。 2、构建了pVr,ri一35S．miRl72e．pA、pVmI．35S．miR319b+402+393c．pA两种植物表达载 体，并转入拟南芥中。研究发现，在长日照下，miRl72高表达转基因拟南芥比野生 型拟南芥提前20天开花，并且不影响植物的J下常生长发育。将miR319、393、402 串联高表达于拟南芥植物中，转基因拟南芥和野生型拟南芥于4℃下弱光培养40天， pVKH．35S．miR319+402+393一pA高表达转基因拟南芥除部分果夹和种子发育不正 常外，表型无明显变化，而野生型拟南芥叶片大量变黄，并逐渐死亡。说明miR319、 393、402串联在一起，能提高植物的耐寒性。 3、本研究采用比较基因组学的方法，根据miRbase数据库中已公布的miRl72、miR3 19、 IIliR393、miR402序列，设计特异性引物，通过PCR获得了木薯miRl72、miR319a、 IIliR3 19c、miR393、miR402的前体序列，长度分别为124bp、176bp、179bp、96bp、 121bp，并将其进行二级结构折叠，都可以形成发夹结构。再利用前体序列推测出 miRNA的成熟序列，木薯miRl72成熟序列为5-agaaucuugaugaugcugeau．3’。木薯 miR319a成熟序列为5-uuggacugaagg gagcueeeu-3’，木薯miR319c成熟序列为 5-uuggaeugaagggagcuccuu-3’，木薯miR393成熟序列为5-uecaaagggaucgcauugauc-3’， 木薯miR402成熟序列为5’-uucgaggccuauuaaacctgga-3’。 4、木薯是世界三大薯类作物之一，具有全年可种植、易栽培、高度耐旱、产量高等优 良特性，在热带地区广为种植。但是作为典型的