miR22调控Vecadherin的表达及其在炎反应和血管生成中的作用.docx

华中农业大学2016届硕士研究生学位论文 3．4．1反转录体系及程序 19 3．4．2 miI心IA反转录体系及程序 ．．20 3．5荧光定量PCR(qPCR) 20 3．6蛋白质印迹技术(Western bloO 21 3．6．1细胞总蛋白的提取及浓度测定 21 3．6．2 SDS．聚丙烯酰胺凝胶电泳 21 3．6．3转膜 ．22 3．6．4封闭 ．22 3．6．5抗体的杂交 22 3．7细胞转染 ．23 3．8 Poly(I：C)刺激实验 23 3．9 MTT法检测细胞活性 ．23 3．10 MPO活性检测实验 24 3．1 I胚胎显微注射 24 3．12整体原位杂交(whole—mount in s／tu hybridization) 。24 3．13靶基因预测 25 3．14荧光素酶报告实验 25 3．14．1野生型荧光素酶报告载体的构建 ．25 3．14．2突变型荧光素酶报告载体的构建 ．26 3．14．3重组质粒与模拟物或者抑制剂共转染HUVECs细胞 27 3．14．4双荧光素酶活性检测分析 27 3．15数据统计 27 4结果分析 28 4．1 miR-22靶基因预测及鉴定 ．28 4．1．1 miR-22靶基因预测 。28 4．1．2 miR．22靶基因鉴定 28 4．2过表达miR-22对VE-cadherin表达的影响 ．3l 4．2．1 qPCR检测miR-22对VE．cadhcrin rnRNA表达的影响 31 4．2．2 Western Blot检测miR-22对VE-cadherin蛋白表达的影响 ．32 4．3 miR-22参与调控血管内皮炎症反应 ．33 4．3．1 qPCR检测猪肺组织中miR-22和VE．cadherin的表达 33 Ⅱ 万方数据  miR-22调控VE-cadherin的表达及其在炎症反应和血管生成中的作用 4．3．2 Poly(I：C)刺激HUVECs，qPCR检测miR-22和Ⅶ-cadherin的表达 34 4．3．3 qPCR检测过表达miR-22对HUVECs细胞炎性因子表达的影响 ．35 4．3．4 MTT实验检测过表达miR-22对细胞增殖的影响 35 4．3．5 qPCR检测过表达miR．22对小鼠肺组织中炎性因子表达的影响 ．．36 4．3．6 miR-22过表达对小鼠肺组织MPO活性的影响 37 4．4 miR-22过表达对斑马鱼血管发育的影响 ．37 4．4．1 qPCR检测斑马鱼胚胎发育时期miR-22的时空表达特性 ．．37 4．4．2 miR-22过表达对斑马鱼发育的形态学影响 ．．38 4．4．3 qPCR检测miR-22过表达对斑马鱼VE．cadherin表达的影响 39 4．4．4 Western Blot检测miR-22过表达对斑马鱼VE-cadherin表达的影响 40 4．4．5荧光显微镜观察miR-22过表达对斑马鱼血管发育的影响 40 4．4．6整体原位杂交检测miR-22对血管标记基因flil表达的影响 4l 4．4．7 qPCR检测miR-22过表达对斑马鱼血管标志基因表达的影响 一42 4．5外源注射VE．cadherin mRNA对斑马鱼血管发育的补偿作用 。43 4．5．1荧光显微镜观察VE．cadherin的mRNA对斑马鱼血管发育的影响 一43 4．5．2整体原位杂交检测VE．cadherin对flil表达的影响 44 4．5．3 qPCR检测VE-cadherin对斑马鱼血管标志基因表达的影响 ．．45 5讨论 ．46 5．1 miR-22靶基因的预测及验证 46 5．2 mkR-22参与调控炎症反应 47 5．3 miR-22抑制vE．cadhcrin的表达影响斑马鱼血管发育 48 6本研究得出的主要结论 49 参考文献 50 致谢 58 Ⅲ 万方数据  miR-22调控VIE．cadherin的表达及其在炎症反应和血管生成中的作用 摘要 血管内皮屏障，控制着血管与相邻组织间的物质交换，其功能的实现主要依赖 于血管内皮细胞间的黏附连接。血管内皮细胞钙黏蛋fl WE．cadherin)作为黏附连接 中的主要蛋白，其分布与功能状态的改变直接影响着血管内皮屏障功能的实现。 微小RNA(miRNA)是一类长为19．25nt的非编码小分子RNA，能与靶基因 mRNA的3’UTR上的序列结合，通过诱导靶rnRNA降解或抑制蛋白翻译，在血管 生成、炎症反应与疾病发生等生物学过程中发挥关键作用。 miR-22是由22个核苷酸组成的小RNA，具有高度的保守性，并在疾病组织中 呈现表达差异。研究表明，miR-22在胚胎发育、肿瘤发