GST与WTAP蛋白的克隆 表达纯化以及初步晶体学研究.docx

中 国科 中 国科 学 技 术 大 学 硕 士 论 文 摘 要 摘 要 1 . G S AT 的 克 隆 ，表 达 和 纯 化 以及 初 步 晶体 学 分 析 5一氨 基 酮 戊 酸 (5一am ino lev ul ini c ac id ，A LA ) 是 四碳 合 成 途 径 当 中首 要 的供 体 ，植 物 ， 藻类 和 一 些 细 菌 也 可 以通 过 五碳 途 径 从 谷氨 酸 合 成 5一氨 基 酮 戊 酸 。在 这 个 途 径 中一 系 列 的 酶 发 挥 着 重 要 的 作 用 ， 谷 氨 酸 一l一半 醛 转 氨 酶 (G luta m a te一1一se m ia ld e hyd e a m inotran sfe rase ，G 匀订) 是 这 个 途 径 的 最 后 一 个 酶 。其 他 两 个 重 要 的酶 是 谷 氨 酸 一tRN A 合 成 酶 和 谷 氨 酸 一tR NA 还 原 酶 。谷 氨 酸 一1一半 醛 转 氨 酶 在 促 使 谷 氨 酸 合 成 5一氨 基 酮 戊 酸 过 程 中发 挥 最 重 要 的作 用 ， 我们 从基 因组 文 库 中克 隆 了 GSAT 的 CDS 序 列 ，并 构 建 了 G SAT一p28a 质 粒 。重 组 蛋 白 GSAT一Hi sTa g 在 五 co 1，’ B L2 1 (DE3 ) 中表 达 量 高 ，用 Ni 亲 和 柱 纯 化 后 纯 度 达 到 95 % 以上 。 蛋 白质 在 浓 缩 和 脱 盐 过 程 中 比较 稳 定 ，动 态 光 散射 实验 证 实 重 组 蛋 白不 存 在 多聚现 象 。用 悬 滴气 相 扩 散法 经 过 筛选 和 优 化 得 到 了 GS AT 的结 晶 。 X一Ray 衍 射 表 明 晶体 的衍 射 分 辨 率 可 达 到 2 .0A 。完 成 了晶体衍 射 数据 的收集 ， 晶体 空 间群 为 C2 ， 晶胞 参 数 为 a= IH .428 A ， b=56 .469 A ， e=8 1.oZsA ，p = 131.925’。分 析 计 算 和 自旋 pa tter son 函数 计算 均 表 明 ，一 个 晶体 学 不对 称 单位 含 有 一个 蛋 白质 分 子 。 以 枷 echococc 。 的 GsA T (3GSB ) 为 结 构模 型 ， 用 分 子 置 换 法 己获 得 结 构 的初 相 位 解 析 。结 构 模 型 的精 化 过 程 正 在 进 行 中 。 关键 词 : 5一氨 基 酮 戊 酸 ，谷氨 酸一1一半 醛 转 氨 酶 ， 晶体 缩 写词 : A LA : 5一氨 基 酮 戊 酸 (5一am ino levu lin ie ae id) ; G S A T : 谷 氨 酸一1一半 醛转 氨 酶 (G lutem a te一1一se m ia ld e hyd e a m ino transfe rase ，) 2.wTAP 的克 隆，表 达 ，纯 化 和 结 构研 究 肾细 胞 肿 瘤 抑 制 基 因盯 1对 于 泌 尿 生 殖 系 统 的 发 育 有 很 重 要 的 作用 。虽 然 很 多 目的 蛋 白 基 因 己经 鉴 别和 一 些WT I结合 蛋 白 已经 获 得 ，但 是 对 于WT I的作 用 机 制 还 是 没 有 研 究清 楚 。我 们所 研 究 的蛋 白WT A P 即 肾细 胞 肿 瘤 抑 制 基 因 邢份相 关 蛋 白，由于其 特 别 的表 达 方 式 ，因而 可 能表 明其 具有 一 些 基 本 的细 胞 内功 能 . 由于盯 A P是 一个 细 胞 核 内蛋 白，和WT I基 因一样 通 过 中 中 国科 学技 术 大学 硕 士 论文 摘 要 核 质 .虽 然 两 者 之 间 的相 互 作 用 还 没 有 明确 ，但 是 从 现 有 的研 究 结 果 表 明， 盯 AP 是 一 个 具 有 重 要 意 义 的 蛋 白. 在 WTI 上 有 两个 可 以选 择 的剪 切位 点，一个 是 17 个 氨 基 酸 ，含 有 5 个 外 显 子 ;第 二个 可 以增 加 与删 除 的是 三 个 氨 基 酸 (KTS) 即赖 氨 酸 ，苏氨 酸 和 丝 氨 酸 ，存 在 于第 9 与第 十个 外 显 子之 间 。根据 着 两 个 位 点 的存 在 与 否 ，WTI 可 以划 分 为 主 要 的 四种 异 构 体 。文 献报 道 的研 究 结 果表 明 ，WT I 发挥 作 用 是 必 须 与 WT AP 相 互 结合 。通 过 其 序 列 分 析 ，我 们 认 为这 个 结合 位 点应 该在 N 端 ，所 以设 计 实验 来进 而 证 明我 们 的推 测