miR34a在H2O2诱导人晶状体上皮细胞凋亡中的表达情况及作用机制的研究.docx

硕士学位论文目的 硕士学位论文 目的 本研究首先以H202诱导人晶状体上皮细胞株HLE．B3凋亡，再检测而R-34a 表达情况，探讨在氧化应激过程中人晶状体上皮细胞miR．34a的表达水平，旨在 从表观遗传学角度揭示白内障发病机理，为白内障治疗寻找新的思路。进一步 采用慢病毒转染的方法构建高表达miR．34a的人晶状体上皮细胞株HLE-B3，再检 测细胞凋亡和衰老情况，并在mRNA和蛋白水平检钡lJbcl．2和SIRTl的表达情况， 探讨miR一34a的生物学功能及其对bcl．2、SIRTl的调控作用，为以miR．34a及相关 分子为靶点的白内障靶向治疗提供实验依据。 方法 1．晶状体上皮细胞培养与处理 人晶状体上皮细胞(HLE．B3)细胞株，购自美国ATCC。细胞用含有10％FBS 的低糖DMEM培养基培养，于37。C、体积分数5％的C02饱和湿度的细胞培养箱 内培养。细胞达到80％．90％融合后，用H202浓度为2009M的低糖DMEM处L里24h。 2．构建和验证过表达miR．34a的人晶状体上皮细胞模型 构建携带miR-34a的慢病毒载体，用慢病毒包装系统共转染包装细胞293T， 包装产生慢病毒，用以感染人晶状体上皮细胞，采用嘌呤霉素进行筛选，细胞 提取RNA进行qRT-PCR检测。 3．流式细胞术检测细胞凋亡 收集细胞，采用ApoScreen Annexin V Apoptosis Kit(SouthernBiotech，USA) 进行染色，流式细胞仪检测。 4．衰老相关B．半乳糖苷酶染色检测细胞衰老 细胞接种于6孔板，采用B．半乳糖苷酶染色试剂盒(碧云天，杭州)对细 胞进行固定和染色，普通光学显微镜下观察染色结果并进行衰老细胞计数，衰 老细胞镜下呈深蓝色着染。 5．qRT-PCR检测细胞内bcl一2、SIRTl mRNA的表达 提取细胞总RNA，采用cDNA Synthesis System 1试剂盒进行逆转录，按照 儿I 万方数据 摘要SYBR 摘要 SYBR Green qPCR SuperMix试剂盒说明在ABI PRISM@7500 Sequence Detection System定量PCR仪进行荧光定量PCR 6．western blot检测细胞内bcl．2、SIRTl蛋白的表达 收集细胞，提取总蛋白，取109l蛋白上样于聚丙烯酰胺凝胶进行电泳；转 移样品蛋白于PVDF膜上，5％BSA室温封闭lh，一抗40C孵育过夜；TBST 洗膜3次，二抗室温孵育2h；TBST洗膜3次后，浸入增强化学发光试剂，暗 室X线片压片曝光，洗片。图片经光密度图像扫描仪扫描，FlourChem程序测 定条带光密度值。 7．统计学分析 所有数据以均数-!-标准差表示，符合正态分布且方差齐者采用两个独立样本 t检验，方差不齐采用t’检验，重复测量资料采用重复测量方差分析，用SPSSl3．0 统计软件进行统计分析，以PO．05为有统计学意义。 结果 1．H202诱导晶状体上皮细胞调亡 H202处理细胞后，死亡细胞不再贴壁，悬浮于培养基中，失去固有形态， 呈圆形，折光性明显最高。存余的贴壁细胞变得稀疏，细胞皱缩、轮廓增强、 边缘僵硬，细胞核与细胞浆界限不明显。在H202组和对照组细胞凋亡率分别是 15．17士0．70％和6．24士0．55％，差异有统计学意义(P0．01)，H202组晶状体上皮细 胞的凋亡率高于对照组，成功构建研究白内障的细胞模型。 2．H202促使晶状体上皮细胞miR．34a表达水平升高 H202组和对照组miR．34a相对表达量分别为2．76士0．41、1．00士0．25，与对照组 相比，H202组miR．34a表达升高，差异有统计学意义(n=3，PO．01)。 3．慢病毒介导过表达miR．34a稳定细胞株构建及阳性细胞筛选 慢病毒成功感染的细胞表达红色荧光蛋白，在倒置荧光显微镜下观察，细 胞可见红色荧光。miR-34a组和空载体组中miR-34a相对表达量分别为 18．69-j：3．71、1．00士0．02。与空载体组相比，miR-34a组中miR-34a表达量明显升高 1V 万方数据 硕士学位论文(n-3，P(0．01)，成功构建过表达miR一34a的人晶状体上皮细胞株。 硕士学位论文 (n-3，P(0．01)，成功构建过表达miR一34a的人晶状体上皮细胞株。 4．miR．34a可促进入晶状体上皮细胞凋亡 miR-34a组和空载体组细胞凋亡率分别为27．83士0．20％、10．64士0．15％， miR-34a组细胞凋亡率高于空载体组，差异有统计学意义(n=3，P(0．01)。 5．miR-34a可促进入晶状体上皮细胞衰老 衰老的细胞SA-D．gal染色阳性， rniR．34a组和空载体#tSA一0-gal