miR34a通过下调SIRT1抑制肺癌细胞增殖和凋亡机制研究.docx

第三章miR．34a靶向调控SIRTl基因的表达研究 第三章miR．34a靶向调控SIRTl基因的表达研究 48 一材料与方法 ．48 1材料 48 2方法 50 二结果一；日爿K ．．．．j )上51 1荧光定量PCR检测结果 ．．51 2 BrdU细胞增殖实验结果 52 3 Western blot检测结果 ．．． ．■ ．53 三讨论 - 54 四小结 ： ．56 参考文献 ．．57 综述 70 综述参考文献 一 80 在学期间发表文章 ．．89 致谢 90 万方数据 解放军医学院博士学位论文英文缩略词表 解放军医学院博士学位论文 英文缩略词表 Abb reviation 万方数据 解放军医学院博士学位论文作 解放军医学院博士学位论文 作 者：贾友超 学科专业：肿瘤学 导 师：焦顾昌 mi R-34a通过下调S l RTl抑制肺癌细胞增殖和促凋亡机制 研究 中文摘要 背景 肺癌为目前全球范围内死亡率排名第一位的恶性肿瘤。在最近的几十年 来，我国肺癌的发病率以及死亡率居高不下，据世界卫生组织(World Health 0rganizat ion，WH0)评估，2025年我国肺癌患病人数将居全球之首。I期肺 癌患者若立即进行手术切除，jn《其5年生存率可达92％，而未经治疗的I期 肺癌患者则将在5年内死亡，而I～IV期肺癌患者的总体5年生存率仅为15％ 左右。所以，早期诊断以及治疗能够有效提高肺癌患者的存活率。miRNA (microRNAs)为具有多种生物学功能的小分子RNA，在生物体生长发育、生 理功能特别是在恶性肿瘤的发生和发展过程中有重要作用，因此日益成为广 大生命科学研究工作者们探索的热点内容。miRNA与人类恶性肿瘤形成的多 条信号传导通路密切相关，既可作为癌基因参与肿瘤的发生和发展，亦可发 挥抑癌基因的功能抑制肿瘤的生成和恶化。目前的研究已证实，人体中约有 三分之一以上的基因是由miRNA所调节的。miRNA经由对其靶基因进行调控， 参与人体生理过程调节，同时与人类多种恶性肿瘤，如胃癌、乳腺癌、肺癌 等的发生和发展过程有关。本文就近年来关于miRNA与肺癌关系的文章予以 综述并对miR-34a下调SIRTl影响肺癌细胞增殖及凋亡进行实验证实，旨在 加深对肺癌发生和发展的分子机制以及病理变化的认识，为增加肺癌治疗手 段、有效提高肺癌诊疗水平奠定理论基础。 2 万方数据 解放军医学院博士学位论文目的 解放军医学院博士学位论文 目的 本文通过研究miR-34a以及SIRTl在人非小细胞肺癌(non-small cel l lung cancer，NSCLC)组织中的表达及意义，以及miR-34a在4‘e-*4 NSCLC细胞 增殖、促凋亡以及调控细胞周期的作用机制，旨在为开发新的治疗NSCLC药 物以及制定NSCLC临床治疗新方案提供实验依据。 方法 (1)采集50例NSCLC患者的癌组织样本以及10例相应癌旁正常组织样本， 通过运用荧光定量PCR方法检测上述样本中miR-34a和SIRTl mRNA的转录， 同时通过蛋白质免疫印迹(wes tern blot)法明确SIRTl蛋白的表达情况， 分析miR-34a和SIRTl表达与NSCLC患者临床病理参数的相关性。 (2)将miR-34a模拟物(miR-34a mimic)转染人NSCLC H1299细胞；荧光 定量PCR检测细胞中miR-34a的转录；运用MTT法检测miR一34a对细胞增殖 的影响；Annexin V-FITC／PI双染法检测miR一34a对细胞凋亡的影响；用流 式细胞术检测miR-34a对细胞周期的影响；用Transwel 1小室法检测miR一34a 对细胞的侵袭能力的影响；细胞划痕实验检测miR一34a对细胞迁移能力的影 响。 (3)将H1299细胞随机分为2大组：即①mimiC阴性对照组：转染相同浓度 的miR-mimics-mock，miR-34a mimiC组：转染miR-34a mimic；②抑制剂阴 性对照组：不加入miR-34a抑制剂，miR-34a抑制剂组：加入40 nm01／L miR-34a 抑制剂。荧光定量PCR检测各处理组中miR-34a的表达情况；运用BrdU细胞 增殖实验检测各组细胞的增殖情况；western blot法检测各处理组中SIRTl 蛋白的表达情况。 结果 (1)NSCLC患者的癌组织样本中miR-34a的表达较相应癌旁正常组织明显降 低；NSCLC患者的癌组织样本中SIRTl mRNA及相应蛋白的表达较相应癌旁正 常组织明显增高；miR-34a的表达与NSCLC患者的性别、年龄、pTNM分期、 病理类型以及组织病理学分级无关，而与患者是否淋巴结转移有关。SIRTl 的表达与NS