miR34amiR335对srvivin的表达调控及在胃癌中的生物功能学研究.docx

博士学位论文 博士学位论文 芯片技术，筛选出胃癌组织中异常表达的miRNA分子，并研究其生物学功能及 调控机制。目的在于发现临床意义明显，能显著影响胃癌生物学效应的miRNA， 为胃癌的诊断，生物靶向治疗或预后判断提供有价值的信息。 miR．34a、miR-335分子在胃癌组织中通常低表达。在胃癌中，功能上两者 被认为属于抑癌基因。有研究报道，miR-335可以通过作用于其靶基因Bcl．W以 及SPl，抑制胃癌细胞的侵袭、转移能力；而miR．34a可以靶向调控PDGFR及MET 表达，进而抑制胃癌的增殖。然而，由于mircoRNA分子具有多目标靶点的特性， 一种miRNA通常可以靶向多种目标mR_NAs结合，一种目标mRNA也可以被多种 miRNAs调节，形成复杂的调控网络。具体调控机制并没有被研究透彻。 Survivin，1997年新发现的凋亡抑制基因BIRC5，其表达产物Survivin蛋白 由142个氨基酸组成，是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的最小成员。目前研究表明 survivin功能主要表现为两个方面，抑制细胞凋亡，调节细胞周期，同时参与到肿 瘤新生血管的生成。survivin在人类几乎所有的恶性肿瘤中均处于高表达状态。 由于survivin在肿瘤组织中的高表达有高度特异性，一般认为survivin是恶性肿 瘤细胞生存所必需的。已有研究证实了survivin参与了肿瘤细胞的恶变和抗凋亡 的生理过程。因此，survivin被认为是抗肿瘤治疗的一个重要靶点。在胃癌中， survivin的表达同样显著上调，其表达量是一个重要的预后和病理分级的指标。 有大量研究报道survivin基因在胃癌增殖、侵袭、转移、细胞凋亡或肿瘤新生血 管生成中的重要调节作用，但是其上游调控通路并不甚清楚，有研究证实， survivin在胃癌中的表达水平受到miRNA的调控，如miR．34a等。 在胃癌组织中，miR．34a、miR．335的低表达，survivin的高表达，两者之间 是否存在一定的联系。查阅文献，miR．34a通过相应的信号转导通路可以抑制 survivin基因的表达。另外一项研究发现，miR-34a可以直接作用于转录因子 E2F2，来调控survivin基因的表达。那么miR．335是否具有相似的调控机制。 根据生物信息学网站预测，miR．335与survivin mRNA 3’UTR存在可能的结合 位点。因此，miR．34a、miR．335可能具有共同的靶基因，survivin。鉴于survivin 是知名而且重要的癌基因，并且在胃癌发生发展中发挥重要的作用。因而选取 TTT 万方数据 摘要这两个miRNA分子作为本次研究的目标miRNA。 摘要 这两个miRNA分子作为本次研究的目标miRNA。 本研究目的探索miR．34a、miR．335在胃癌中的生物学功能，并研究其调控 机制。血R．34a、miR．335是否可以共同作用于survivin基因，进而调控胃癌细 胞的增殖、凋亡及侵袭。同时通过研究miR．34a、miR．335在胃癌组织中的表达 水平与病人临床病理特征及总体生存率的关系，探索这两个miRNA分子可能的 临床价值及意义。 ‘miR．34a／335．survivin．gastric cancer”调控通路的研究有助于深化认识胃癌 发病的分子机制，同时为胃癌的生物治疗提供新的潜在的靶点。 。方‘法： 1．临床获取8例胃癌组织及相应的癌旁正常组织标本，利用高通量的miRNA 芯片技术(Agilent)检测胃癌组织中异常表达的miRNA分子，结合文献报道， 既往研究结果，从中选出本次研究的目标miRNA，即miR．34a、miR．335分子。 2．生物信息学软件预测miR．335与survivin mRNA 3’UTR存在可能的结合位点。 通过双荧光素酶报告基因实验验证该结合位点。首先根据预测的结合位点，构 建相应的荧光质粒报告基因载体(包括野生型及突变型)。在HEK 293T细胞株 中通过脂质体瞬时转染的方式共转染miR．335 mimic或negative control与构建的 质粒，24h后检测荧光素酶活性的变化。双荧光素酶报告基因实验是经典的用于 miRNA与靶基因结合验证的实验方法，同时检测萤火虫荧光素酶与海肾荧光素 酶活性，海肾荧光素酶作为第二报告基因，起到了减少实验误差的作用。在胃 癌细胞株SGC．7901中重复以上实验，进一步验证结论的可靠性。3．研究miR．34a、 miR-335对其靶基因survivin表达的调控作用。首先利用qRT．PCR技术分别检 测在正常胃粘膜上皮细胞株GES．1，及四种胃癌细胞株AGS，BGC．823， MGC．803，以及SGC-7901中，miR．34a及miR．33