miR548c3p在骨瘤细胞增殖 迁移和侵袭中的作用和分子机制研究.docx

博士学位论文恶性程度，也可作为临床中判断化疗效果的参考指标。 博士学位论文 恶性程度，也可作为临床中判断化疗效果的参考指标。 本课题组在前期研究中通过基因芯片筛选骨肉瘤中差异表达的miRNA发现， miR．548c．3p在骨肉瘤组织和癌旁组织样本中表达具有显著差异性。有研究表明， miR．548d可以诱导细胞凋亡，引起细胞周期阻滞，从而抑制癌细胞的增殖。在 乳腺癌中，miR．548—3p主要通过与ECHSl的3’UTR相结合，抑制ECHSl的表 达，从而抑制乳腺癌细胞的增殖。但目前关于miR-548．3p对骨肉瘤细胞增殖、 克隆形成、迁移、侵袭、周期和凋亡等生物学功能的影响仍不清楚。 研究目的 (1)阐明miR-548c-3p在骨肉瘤组织和细胞中的表达水平，研究其对骨肉瘤细 胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭、周期和凋亡等生物学功能的影响。 (2)阐明miR-548c-3p通过调控靶基因ITGAV影响骨肉瘤细胞增殖和凋亡的分 子机制。 研究方法 第一部分：阐明mLR-548c．3p在骨肉瘤组织和细胞中的表达水平，以及它 对骨肉瘤细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭、周期和凋亡等生物学功能的影响。 第一步：通过荧光定量PCR技术检测miR．548c．3p在20对骨肉瘤细胞株、 骨肉瘤组织和癌旁组织样本中的mRNA表达水平，然后通过统计学方法分析其 中的差异性，从而初步分析miR-548c．3p在骨肉瘤组织和细胞中的表达模式； 第二步：选择miR．548c．3p表达量较低的骨肉瘤细胞株SAOS2进行细胞实 验，合成miR-548c。3p mimics，通过脂质体转染骨肉瘤细胞SAOS2，设三个组： Control组(只加lipofactamine)、NC组(1ipofactamine+NC)和miR．548c一3p组 (1ipofactamine+miR．548c．3p)，通过荧光定量PCR检测miR-548c-3p表达水平 来验证miR一548e．3p的转染效率； 第三步：通过脂质体转染法将Nc和miR．548c一3p转染至骨肉瘤细胞SAOS2， III 万方数据 摘要设control组(只加lipofactamine)，分别在转染Oh、24h、48h、72h和96h等五 摘要 设control组(只加lipofactamine)，分别在转染Oh、24h、48h、72h和96h等五 个时间点取细胞进行CCK8检测，比较Control组、NC组和miR-548c-3p组SAOS2 细胞增殖能力； 第四步：通过脂质体转染法将NC和miR．548c．3p转染至骨肉瘤细胞SAOS2， 设control组(只加lipofactamine)，转染48小时后提取细胞进行实验，进行平 板克隆实验，比较Control组、NC组和miR．548c一3p组SAOS2细胞增殖能力， 流式细胞仪检测三组SAOS2细胞的细胞周期和凋亡的检测，采用PI单染和 PFAnexinV双染法检测在骨肉瘤细胞中过表达miR．548c一3p对肿瘤细胞凋亡的 影响； 第五步：通过脂质体转染法将NC和miR．548c．3p转染至骨肉瘤细胞SAOS2， 设control组(只加lipofactamine)，转染48小时后提取细胞进行实验，分别使 用不含matrixgel和含有matrixgel的transwell小室进行细胞迁移和侵袭能力检测， 分析在骨肉瘤细胞中过表达miR．548c．3p对肿瘤细胞迁移和侵袭能力的影响； 第六步：将转染后的细胞通过皮下注射的方式打入裸鼠腋下部位，细胞分 组为：control组(1ipofatamine组)、NC组和miR．548c．3p组。细胞注射10天后 腋下部位皮下可见肿瘤性凸起，此后每隔3．4天对肿瘤的大小进行测量，记录数 据绘制肿瘤的生长曲线，通过裸鼠成瘤模型分析miR．548c．3p对细胞体内增殖能 力的影响。 第二部分：阐明miR-548c．3p调控骨肉瘤细胞增殖和凋亡的分子机制。 第一步：通过在线软件Targetscan7．0(http：／／www．targetscan．or#)和miRbase (http：／／www．mirbase．org／)预测并筛选miR一548c·3p的靶基因ITGAV； 第二步；提取癌组织和癌旁组织的RNA进行反转录，通过荧光定量PCR 检测ITGAV在骨肉瘤组织和癌旁组织中的mRNA表达情况。提取癌组织和癌旁 组织中的蛋白，通过WESTERN．BLOT检测ITGAV在骨肉瘤组织和癌旁组织中 的蛋白表达情况； 第三步：合成miRNA．548c一3p mimics、NC mimics、miRNA．548c．3p inhibitor 万方数据 博士学位论文和NC 博士学位论文 和NC inhibitor。通过脂