miR664调控靶基因SOX7促进MG63骨肉细胞体外侵袭和迁移机理研究.docx

博士学位论文m 博士学位论文 m i R-664调控靶基因SOX7促进MG-63骨肉 瘤细胞体外侵袭和迁移机理研究 博士研究生：包拥政 指导教师：陈建庭教授 摘要 研究背景： 骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)是主要发病于儿童和青少年且发病率最高的原 发性恶性骨肿瘤。目前应用手术、化疗以及放疗等传统治疗仍有很多病例会出 现远处转移，以肺转移最常见，转移患者存活率仍然较低，骨肉瘤的转移与复 发是影响患者存活率的主要影响因素。因此有必要深入探究骨肉瘤发生侵袭和 转移的机制，通过发现新的治疗手段抑制肿瘤的侵袭和转移以提高骨肉瘤患者 的存活率。但骨肉瘤转移是涉及肿瘤细胞迁移和侵袭为主的多因素、多阶段的 复杂环节，受到多个促肿瘤转移癌基因的调控，目前其转移相关的分子机制仍 未阐明。 miRNA是一类主要存在真核生物中长约18．25个碱基的的非编码的RNA 分子，通过与靶基因的3’UTR碱基互补配对直接抑制mRNA的转录或蛋白质 翻译，在基因转录后的调控中发挥着重要的作用。目前研究发现miRNA与肿 瘤的发生发展密切相关，通过调控不同的靶基因促进或抑制肿瘤发生、增殖、 转移、分化、凋亡以及血管生成的过程。越来越多的研究表明，一些miRNA 在骨肉瘤患者中表达异常，调控着骨肉瘤细胞的发生、增殖、转移、凋亡等生 物学行为。基因芯片筛查发现miR．664在骨肉瘤中过表达并与骨肉瘤患者的存 活率相关，但在骨肉瘤的转移和侵袭中miR．664是否发挥着某种作用以及相应 的靶基目前尚不清楚。 万方数据 摘要研究目的： 摘要 研究目的： 一、选取不同株的人骨肉瘤细胞株以及骨肉瘤组织标本，探究： 1、骨肉瘤细胞株相对于正常人成骨细胞株miR．664的表达水平； 2、骨肉瘤组织相对于癌旁组织miR．664的表达水平。 二、构建miR一664 mimic、miR一664 inhibitor、miR一664 negative control质粒，转 染进入MG．63骨肉瘤细胞株，建立稳定过表达或低表达miR．664的细胞株，利 用Transwell趋化、侵袭实验和细胞划痕实验探究： l、转染miR-664 mimic质粒相对于miR-664 negative control质粒转染的 MG．63骨肉瘤细胞株中骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力； 2、转染miR．664 inhibitor质粒相对于miR．664 negative control质粒转染的 MG．63骨肉瘤细胞株中骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力。 三、利用生物信息学方法预测： 1、miR．664作用的靶基因； 2、检测所筛选的miR．664靶基因的生物学功能及可能的作用信号通道。 研究方法： 1、骨肉瘤细胞培养 人骨肉瘤细胞株SOSP．9607、U2．OS、SAOS．2、HOS、MG．63采用含100U／ml 青霉素和100U／ml链霉素的lO％胎牛血清的RPMI．1640培养基培养，人成骨细 胞株hFOBl．19采用DMEM／F12培养基，在37。C、5％C02、饱和湿度的条件下 传代培养，细胞生长状态良好时用于实验，2～3天换液一次，根据细胞的密度 传代。 2、骨肉瘤组织标本收集 8例骨肉瘤癌组织和对应癌旁组织(adjacent noncancerous tissues，TAT)均 来源于湖南省郴州市第一人民医院及广东省韶关市粤北人民医院标本库，所有 标本均为活体组织取下后即放于液氮中保存直至使用。所有患者均经病理学检 查确诊为骨肉瘤，尚未接受放化疗治疗。本研究经医院伦理委员会批准，所有 万方数据 博士学位论文患者均签署知情同意书。 博士学位论文 患者均签署知情同意书。 3、RNA抽提与荧光定量PCR 分别利用mirVana miRNA抽提试剂盒从培养的细胞和新鲜切除的骨肉瘤 组织中抽提RNA，利用Taqman miRNA逆转录试剂盒合成cDNA，miR．664的 表达水平通过miRNA特异性的TaqMan MicroRNA试剂盒，使用ABI公司的 7500 Real．time PCR仪进行荧光定量PCR反应，检测各模板的Ct值(C为cycle， T为threshold)，每个样品重复3次，阴性对照采用DNase／RNase．free water 为模板，通过相对定量以Folds=2-AAct值代表基因的相对表达强度，公式如下： ．AACt=2。[c‘(miR-664)一c“u6)】 4、Western blot 提取细胞内总蛋白，采用考马斯亮蓝法对蛋白进行浓度测定。采用 SDS．PAGE对蛋白电泳、转膜后，用5％脱脂牛奶封闭，加入SOX7一抗、相 应的二抗，显影和定影。使用仅．tubulin作为内参。 5、细胞的转染 转染前24h，将MG．63细胞用0．25％胰酶消化离心计数后，将细胞密度