miRNA133b在低强度激光照射促进髓间质干细胞增殖中的作用.docx

温州医学院硕士学位论文m 温州医学院硕士学位论文 m i RNA-I 33b在低强度激光照射促进骨髓间质干细胞增殖中 的作用 中文摘要 目的 探讨低强度激光照射(LLLI)促大鼠骨髓问质干细胞(BMSCs)增殖中 miRNA的作用。 方法 体外全骨髓贴壁法原代培养大鼠骨髓间质干细胞(BMSCs)，取生长良好的 第2代细胞作为本实验的研究对象。以InGaAsP半导体激光(635nm，60mw)能 量密度O．5J／cm2照射细胞做为实验组，以未接受激光照射细胞做对照，采用MTS 法绘制细胞生长曲线，TaqMan低密度芯片分析miRNA表达变化，qRT．PCR法 检测细胞周期相关基因表达，生物信息学方法预测芯片中表达变化较大的 miRNA的靶点基因，并对其靶点基因进行基因功能分析。miRNA功能学实验中 利用siPORT NeoFX将miRNA模拟物／抑制剂转染大鼠骨髓间质干细胞，过表 达／抑制芯片中变化较大miR-15b／miR-29b／miR一133b／miR一224／miR一320 5种 miRNA，同时以转染相应的无义核苷酸序列做阴性对照，免疫荧光和TaqMan qRT．PCR验证转染效率，MTS法、Brdu细胞增殖比色法和ki67免疫荧光检测转 染后细胞增殖情况，流式细胞技术(Armexin V／PI双染)和TUNEL免疫荧光分 析细胞凋亡情况。 结果 1．低强度激光照射能够促进体外培养的大鼠骨髓间质干细胞的增殖，增加 细胞周期相关基因的表达。2．f氐强度激光处理影响骨髓间质干细胞miRNA的表 达，miRNA芯片结果提示共有34个miRNA发生1．25倍以上变化。3．过表达 miR．133b能促进BMSCs的增殖(尸O．05)，而抑制miR．1 33b能明显减少BMSCs 的增殖(尸0．05)。且miR．133b对细胞凋亡水平无明显影响。4．miR．133b可能 是通过影响细胞周期相关基因表达发挥其促增殖功能。5．体外抑制miR-133b通 路，能够抑制低强度激光照射介导的BMSCs增殖。 结论miR．133b在低强度激光照射(LLLI)介导的BMSCs增殖中起关键作用， 在临床间质干细胞治疗中可能具有潜在的应用价值。 关键词骨髓间质干细胞；低强度激光照射；miRNA；细胞增殖；细胞凋亡 4 温州医学院硕士学位论文miRNA-·1 温州医学院硕士学位论文 miRNA-·1 33b Pro··proliferation Effect for Bone Mesenchymal Stem Cells after Low．1evel Laser Irradiation Treatment． Abstract Objectives：To investigate the role of miRNAs in the bone marrow derived mesenchymal stem cells(BMSCs)pro．proliferation effect after the Low．1evel laser irradiation(LLLI)treatment． Methods：Primary cultured BMSCs of rats were treated by LLLI，Cell proliferation WaS evaluated by MTS assay，TaqMan low·density microarray analysis of miRNA expression changes，qRT-PCR to detect expression of cell cycle-associated genes． Using miRNA Target data base and bioinformatics analyses we identify 5 miRNAs as potential targets and testify their dynamic changes after LLLI．Through gain-loss—function experiment，primary cultured BMSCs of rats were transfected with 5 miRNAs mimic and inhibitor(miR-15b／miR-29b／miR一133b／miR-224／miR-320)bv siPORT NeoFX to increase or reduce the activity of them,transfected with their corresponding negative control as contr01．The transfection rate were detect