HBV cccDNA水平及临床因素对判断肝细癌术后预后的价值.docx

—_-●_—●__-__-———————-_-__-———-___-———-———_-__-————I___---●_______—————————一。．． 鲞鲨垦型奎兰堕主堂垡笙奎 一 中文摘要 原发性肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是发病率高、预后差的恶性 肿瘤之一。术后高复发率是最终导致患者死亡的重要原因，严重影响HCC的预 后。寻找复发的危险因素，从而采取有效措施预防和治疗复发是提高术后生存 率的最重要策略之一。现有研究表明，肝癌术后复发相关的主要预后因素包括： 肿瘤大小、结节数目、血管浸润、肿瘤有无包膜、术前AFP、转氨酶水平、术中 有无输血及HBV感染等。 目的：利用实时荧光定量PCR的方法检测肝组织及血清HBV共价闭合环状 DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)Tj砰，探讨HBV cccDNAT]平及IIN 床因素对肝细胞癌术后预后的影响。 方法：收集60例自2003年12月．2006年8月住院的乙型肝炎相关HCC患者，记 录患者术前Child．Pugh分级、是否肝硬化、AFP、肿瘤数目、大小、生长方式等 指标，所有病例均留取新鲜的癌组织、癌旁组织和外周血标本，于-80。C冰箱保 存。55例获得完整随访，肝组织DNA以限制性内切酶Hind Ill联合质粒安全的ATP 依赖DNA酶(P1asmid-Safe．ATP．Dependent DNase，PSAD)进行消化，然后采用荧 光定量PCR检测HBV cccDNA和HBV DNA；分析其与临床、病理特征等指标对 无瘤生存率、总体生存率的影响。累积生存率计算采用寿命表法：单因素分析 采用Kaplan．Meier，将单因素分析有统计学意义的变量引人Cox比,例风险模型分 析，P0．05为差异有统计学意义。 结果：60例患者中男性51人，女性9人，平均年龄53．37+11．49岁，5例 无完整的随访资料。55例随访资料完整的患者，最长随访时间88个月，1、3、 5年总体生存率为73％、51％和38％，中位总体生存期36．3个月，生存期超过 6年9例，生存期超过7年2例；1、3、5年无瘤生存率为63％、29％和19％， 中位无瘤生存期16．0个月。实时荧光定量PCR分析表明，血清HBV cccDNA 仅有1例阳。1_生(1／35)，肝癌组织HBV cccDNA阳性率20．0％(1 1／55)，根据13F(总 HBV DNA引物)、13F+PSAD、13F+Nt：]jN+PSAD、71F(ttBV cccDNA选择性引 物)、71F+PSAD、71F+内切酶+PSAD组间定量结果比较，选择性引物、PSAD 和Hind III内切酶三者联合应用，可降低约5个数量级的非特异扩增。癌组织、 癌旁组织总HBV DNA、HBV cccDNA之间均存在正相关(F0．437、0．478， 尸0·05)；外周血总HBV DNA与癌组织HBV cccDNA呈低度正相关性fr：0．359，  天津医科大学硕士学位论文 PO．001)，与癌旁组织HBV cczDNA无相关性(r=0．264，P=0．052)。HBsAg(-)占 20％(11／55)，11例HBsAg(．)病例癌及癌旁组织中HBV DNA检出率100％。 HBsAg(+)组肝癌及癌组织HBV DNA水平较较HBsAg(一)组差异有统计学意义 旧=0．002、0．045)，而HBsAg(+)组肝癌及癌组织HBV cccDNA水平较HBsAg(一) 组差异无统计学意义(尸=0．068、0．435)。单因素分析显示术前AFP水平(P=0．039)、 生长方式(P0．001)、肿块数目(P0．005)、血管侵犯(P0．001)、TNM分期 (P=O．007)、肿块直径(尸=O．028)是影响术后总体生存率的预后因素。Cox模型多 因素分析显示肿块数目俨=0．011)、血管侵犯(户=O．001)是影响术后总体生存率的 独立预后因素。单因素分析显示癌组织HBV cccDNA水平(尸=0．028)、术前AFP 水平(P=0．021)、生长方式(尸=O．019)、肿块数目(P=O．006)、血管侵犯(仁0．048)、 TNM分期(尸=0．027)、病理分级(尸=0．030)是术后无瘤生存率的预后因素。Cox模 型多因素分析显示，癌组织HBV cccDNA水平护=O．007)、生长方式(P=0．002)是 影响术后无瘤生存率的独立预后因素。 结论：本研究表明利用内切酶及PSAD消化肝组织DNA联合HBV cccDNA 选择性引物，进行实时荧光定量PCR检测，可以更特异的测定癌及癌旁组织HBV cccDNA水平。通过5年以上的随访观