HBV感染不同状态下突状细胞的生物学分析.docx

摘 摘 要 目的树突状细胞(dendritic cells，DCs)是一种最具潜能的抗原提呈细 胞，其对抗原进行捕获、加工，处理后提呈给组织相容性复合物(major histocompability complex，MHC)．I、II类分子，诱导T淋巴细胞的增殖， 在增强或调节细胞介导的免疫反应中起着决定性作用。乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus，HBV)感染者DCs的相关研究目前愈来愈受到众多学者 的关注。本课题拟研究慢性乙型肝炎不同感染阶段外周血来源DCs的功能 特点，比较DCs中HBV不同滴度时DCs的功能差异，并研究CpG 0DN能否 促进DCs成熟，增强DCs功能，从而进一步揭示HBV感染不同状态下DCs 的免疫功能。 方法本研究对10例慢性乙型肝炎患者、10例HBV携带者及lO例 健康对照者外周血来源DCs进行体外培养，应用流式细胞技术检测DCs 的表面分子HLA．DR、CD80、CD86的表达，ELISA检测DCs培养上清 IL．12水平，以比较DCs在慢性乙型肝炎不同感染阶段的功能特点；同时 运用荧光定量PCR的方法，对12例慢性乙型肝炎血清HBV。DNA阳性患 者及10例血清HBV—DNA阴性患者外周血来源DCs内的HBV．DNA进行 了检测，并比较DCs中HBV不同滴度时DCs的功能差异；通过予以含 非甲基化CpG基序的寡脱氧核苷酸链(unmethylated CpG motif containing oligodeoxynucleotides，CpG ODN)干预，研究CpG ODN能否有效促进 DCs成熟，增强DCs功能。 厶七甲171木 (1)实验结果显示，体外用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI．1640完全 培养基(iJHGM．CSF矛NIL一4)诱导人的外周血单个核细胞(peripheral 培养基(iJHGM．CSF矛NIL一4)诱导人的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)来培养DCs， 24小时后可见贴壁单核细胞聚集 成大小不等葡萄串状，粘附于培养板底，第3天可见这部分细胞体积增大， 第4天可见部分细胞悬浮于细胞培养液，第5天可见这部分细胞数目增多， 部分细胞出现许多毛刺。第7天培养液中飘浮着大量有明显树突状的大个 细胞或细胞团。将培养7天的DCs收集在透射电镜下观察，每个视野充满 DCs，可见细胞体积较大，细胞表面突起比较丰富，胞浆内粗面内质网丰 富，线粒体结构较清楚，溶酶体丰富，核大而圆，核膜清晰，染色质分布 较均匀。慢性乙型肝炎患者及HBV携带者HLA．DR、CD80和CD86的表 达率较正常对照组普遍降低，但HLA．DR、CD80和CD86的表达水平在慢 性乙型肝炎患者及HBV携带者之间的差异无统计学意义。ELISA检测培养 第7天DCs上清IL．12水平，发现在DCs培养上清液中，IL．12的表达水平在 慢性乙型肝炎患者及携带者明显低于正常人，而慢性乙型肝炎患者与携带 者之间则无明显差异。 (2)对12例慢性乙型肝炎血清HBV—DNA阳性患者及10例血清 HBV．DNA阴性患者外周血来源DCs内的HBV．DNA进行检测发现：12 例血清HBV—DNA阳性患者，其中有7例其DCs内可检测到HBV．DNA， 5例DCs内未检出HBV．DNA，DCs内HBV．DNA检出率为58．3％。流式 细胞仪分析显示，正常人的皿A．DR、CD80和CD86的表达阳性率均 在58％以上，而慢性乙型肝炎血清HBV-DNA阳性组及血清HBV-DNA 阴性组HLA—DR、CD80和CD86的表达率较正常人组普遍降低，尤以 血清HBV-DNA阳性组下降更为明显。7例DCs HBV-DNA阳性组及15 例DCs HBV-DNA阴性组甩A．DR、CD80和CD86的表达率亦较正常 II 人组普遍降低，尤以DCs 人组普遍降低，尤以DCs HBV-DNA阳性组下降更为明显。DCs培养上 清IL．12水平在血清HBV-DNA阳性组明显低于血清HBV-DNA阴性组及 正常人组，血清HBV-DNA阳性组又低于血清HBV-DNA阴性组。而IL．12 的表达水平在DCs HBV-DNA阳性组明显低于DCs HBV-DNA阴性组及 正常人组，DCs HBV-DNA阴性组又低于正常人组。相关分析显示，DCs 表面分子的表达及DCs分泌IL一12水平与血清及DCs HBV载量均呈显著 负相关。 (3)将培养第6天的DCs，加入CpG ODN继续培养24d,时后，透射 电镜观察CpG ODN刺激后DCs与完全培养基对照组DCs相比，其表面的 突起丰富、增粗，粗面内质网增多，空泡减少甚至消失。用流式细胞仪分 析显示，CpG ODN束U激组