MMPsTIMPs及TGFβ1反义寡核苷酸对糖病肾病细胞外基质调控的实验研究.docx

中文摘要(目 中文摘要 (目 的 糖尿病几乎在世界所有人群中均可发现，随着世界经济的发展，糖尿病 的患病率逐年提高，由于整个社会医疗水平的提高，糖尿病患者的平均寿命 明显延长，糖尿病的慢性并发症已成为影响其预后的最主要因素之一。在 1型糖尿病患者中，糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是其死亡的主要 原因。而且大部分合并DN的1型糖尿病患者多提前死于心血管疾病，其 危险性比未合并者高20～40倍。在美国，终末期肾病的最常见原因是糖尿 病，美国肾移植治疗中33％为糖尿病病人。国内南京地区对642例糖尿病 患者肾脏病变的调查表明，DN的总发生率为47．7％。DN的基本病理改变 为肾小球毛细血管基底膜增厚和系膜区扩张，目前有关DN的病因和发病 机制尚未完全阐明，但主要有以下几种可能的机制：①肾小球血液动力学的 改变：肾小球内存在高灌注、高滤过、高内压；②糖代谢异常：由于持续的高 血糖导致多元醇代谢通路的激活、蛋白激酶c活性的增加、糖基化终产物 的大量形成；③遗传易感性：未完全明了，可能是多基因、多因素综合影响的 结果；④细胞因子的作用：它们将引起肾小球血流动力学改变，系膜细胞肥 大、增殖，细胞外基质增加。目前研究较多的细胞因子为TGF一[31，其升高 是引起系膜细胞外基质累积的基础，也是造成肾小球系膜基质堆积的主要 致病因子，它可刺激系膜细胞外基质蛋白的合成，能够抑制分解细胞外基质 的MMPs的活性，能够增加其抑制剂TIMPs的活性，从而促进细胞外基质的 沉积。 许多酶类可以降解细胞外基质成分中的大分子蛋白，MMPs被认为是 重要的一类，含有锌原子，其活性依赖于钙离子，直接以酶原的形式分泌到 细胞外基质中，并在正常生理条件下发挥作用，它的表达及调控受到严格的 控制，它是迄今为止发现的唯一能分解纤维类胶原的酶。TIMPs家族是一 个多基因家族的编码蛋白，是一种抑制MMPs活性的糖蛋白，是MMPs的天 然的特异性抑制剂，可以结合在MMPs的活性部位，阻止MMPs与其底物的 √．—J √ ．—J 、／ 相互作用√本实验就转化生长因子§1(transforming growth factor一131，TGF ～B1)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)及其组织抑制剂 (tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs)、细胞外基质(extracellular ma- trix，ECM)与糖尿病肾病之间关系作一简单的探讨，同时观察TGF—pl反 义寡核苷酸对高糖下系膜细胞的抑制作用，力求在分子水平为糖尿病肾病 的合理有效的治疗提供理论基础。 厂 (：b- 法 ；i 将60只Wister大鼠随机分成2组：即正常对照组(C组)10只，糖尿病 组(DM组)50只。糖尿病模型用STZ建立。具体方法是：将STZ粉末用 50mmol／L的柠檬酸缓冲液新鲜配制成pH=4．5，浓度为2％的溶液，按剂量 为60mg／kg(大鼠体重)腹腔内注射，72小时后取大鼠尾部血，凡是空腹血 糖／16．7mmol／L，作为糖尿病大鼠(共有43只成模)；同时正常对照组给与 同等量的生理盐水腹腔注射。糖尿病组大鼠分别于2周、6周、10周、16周 分别处死10只，留取标本，左肾用10％的中性甲醛溶液固定，常规石蜡包 埋切片，切片厚度为4td，右肾用于Western印迹杂交及透射电镜。 大鼠系膜细胞的培养，参见谌贻璞等的方法：将大鼠快速处死，无菌条 件下取出肾脏，剔取肾皮质，剪碎，将肾皮质碎块用Hank’S液洗涤2次，倒 入三道重叠的不锈钢网(由上至下分别为80目、150目、200目)。在最上 层的筛网上轻碾肾皮质，同时用4℃的Hank’s液冲洗，在最下层筛网上收 获肾小球。将用Hank’S液冲洗收集到的肾小球混悬液以1000r／min离心3 分钟，弃上清，用Hank’S液洗涤2次。Ⅳ型胶原酶(19／L)lOml，37。C震荡 水浴，30分钟，得到肾小球残体，加入完全培养液后，将其分别接种于 100mm3的一次性塑料培养瓶中，置于37。C，95％湿度，5％CO：的条件培养 箱中连续培养，培养液的胎牛血清浓度为20％(通常所称的生长液)，大约 2—3周左右长满瓶底，用胰蛋白酶(O．2％)一EDTA(0．02％)液进行消化后 传代至实验所用的6孔板或24孔板上，在培养板上所用的胎牛血清的含量 为5％(通常所称的维持液)，用于本实验的细胞最终在8—12代。 取培养瓶中对数生长期的GMC调成2×105／ml转接种于24孔板上， 每孔lml。贴壁生长24小时以后，改换成无血清的培养基，24小时以后细 胞基本同步化，再根据实验分组的不同加入相应的培养液，每组设4个平行 ·2· 孔(重复孔