HIV1RNA双重实时荧光RTPCR测定方法及其质物和标准物质的系列研究.docx

中国协和医科人学博士学位论文英文缩略语 中国协和医科人学博士学位论文 英文缩略语 Amp Ampicillin 氨苄青霉素 bp Base pair 碱基对 BSA Bovine albumin 牛血清向蛋白 cDNA Complementary DNA 互补脱氧核糖核酸 DEPC Diethylpyrocarbonate 二乙基焦炭酸盐 DMS0 Dimethy lsulfoxide l二甲基砸砜 DNase Deoxyribonulcease 脱氧核糖核酸酶 dNTP Deoxynucleotide triphosphate 脱氧核苷二磷酸 盯n bithiothreitol 二硫苏耱醇 EB Ethidium bromide 溴化乙锭 EDTA Ethylenediamine tetracetic acid 乙二胺四乙酸 Fcs Fetal calf serum 胎牛血清 HRP Horse—radish peroxidase 辣根过氧化物酶 IPTG Isopropylthi—B—D—galactoside 异丙基硫代一B—D半乳糖苷 kb Ki lobase 千碱基 kD Kilodalton 干道尔顿 LB Luria—Bertani medium LB培养基 B一旺 p-mercaptoethanol B一巯基乙醇 OD Optical density 光密度 PAGE Polyacrylami de gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PBS Phosphate—buffered sal ine 磷酸缓冲盐溶液 PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链反应 PEG Polyethylene glycol 聚乙二醇 RT—PcR Reverse transcription—Polymerase 逆转录聚合酶链式反应 chain reaction rpm Round per minute 转／分 SDS Sodi dodecyl u lfate 十_二烷基磺酸钠 Tris Trishydroxymethytaminomethane 二静甲基氮基甲烷 X—gal 5-bromo一4一chloro一3一indolyl一6 5一溴一4一氯一3一吲哚一p—D半乳 一D-galactoside 糖苷 9 中国协和医科大学博士学位论文HIV一1 中国协和医科大学博士学位论文 HIV一1 RNA双重实时荧光RT～PCR测定方法 及其质控物和标准物质的系列研究 中文摘要 目的 建立新型的采用病毒样颗粒作为内质控的HIV-RNA双重实时荧光RT—PCR测定 方法。制备无生物传染危险性且剜RNase的HIV—IRNA检测血清质控物和标准物质， 用于临床实验室的室内质量控制和室间质量评价工作。 方法 一、HIV—RNA双重实时荧光RT—PCR测定方法 1．从美国Los Alamos国家实验室网站和NCB[网站下载所有已知H【v～1 序列，采用DNAKAN和BioEdi t软件进行比对，获取HIV-1序列的保守区域序 列。再利用软件Primer Express(美国应用生物系统公司)进行实时荧光PCR 引物和探针设计，并初步建立实时荧光PER检测体系。 2．在上述的HIV一1 RNA实时荧光PCR检测体系中，加入上面设计的不同 的探针和引物，检测本室构建表达的内含HIV-1 RNA的病毒样颗粒和HIV—l感 染患者样本，筛选合适的引物和探针。初步确定了双引物双探针的检测体系。 根据双引物双探针体系构建重组质粒表达内含HIV-1 RNA内标的病毒样颗粒， 确定内标病毒样颗粒在反应体系中的最适浓度。通过不同添加剂的加入和不同 酶混合物的调整优化RT—PCR反应体系。 3．采用两条不同的荧光探针和两组引物进行国际标准血清盘和HIV一1感 染者血清标本的HIV一1RNA检测，并利用上述构建表达的病毒样颗粒作为内标 以进行假阴性质控，考察了所建立方法的检测灵敏度和特异性。比较了单探针 和双探针检测方法在亚型检测能力、检测灵敏度和临床样本的检测适用性。 二、MS2包膜蛋白的原核表达、纯化以及抗MS2蛋白多克隆抗体的制备及其与 RNA的体外相互作用 1．构建表达包膜蛋白的pET．：-COAT、pGEX-4t—I-COAT原核表达质粒和 pcDNA3．1-COAT真核表达质粒。原核表达重组MS2包膜蛋白。将重组蛋白利用 亲和柱进行纯化，纯化后的包膜蛋白进行尿素梯度透析。 2．分别采用原核表达重组蛋白免疫l号和3号两只家兔、采用真核