MTA1蛋白在人髓母细胞瘤的表达及调侵袭转移机制的研究-神经外科专业毕业论文.docx

硕士学位论文 而且染色强度评分加阳性细胞百分比评分所得结果芝2时，即为免疫反应(+)， 否则为(．)。 MTAl一siRNA转染Daoy细胞：我们从ATCC公司购得髓母细胞瘤Daoy细 胞株，同时化学合成针对MTAl的小干扰序列即siRNA、无义对照序列niRNA、 质粒载体Lipofectarnine 2000，将Daoy置于DMEM培养基中，37。C、5％的C02 恒温箱内培养至对数生长期后，通过Lipofectamine 2000将化学合成的 MTAl．siRNA及无义序列MTAl．niRNA转染Daoy细胞内，恒温箱内孵育48—96 h， 同时以转染质粒载体作为空白对照组。 RT-PCR检测MTAl mRNA表达：Tfizol法提取总RNA，利用紫外分光光 度计(Qcon_tlⅡns)测纯度和浓度，取299总RNA，用逆转录酶进行反转录，取cDNA 5肛L作PCR扩增，94℃变性30 S，55V退火40 S，72。C延长30s，扩增长度为210 bp，最后利用凝胶电泳后分析结果，以MTAl和13-actin扩增带的吸光度比值来 评价MTAl mRNA的表达水平。 Western blot检测MTAl蛋白表达：收集各组细胞，提取细胞蛋白、上样， 通过12％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品后转膜，室温封闭后加入稀释浓度为1： 200的羊抗人MTAl多克隆抗体，4C孵育过夜后，加入相应二抗，孵育、暗室 曝光、显影、定影及分析，其中我们以13-actin作为内参标志物。 细胞粘附能力实验：待转染48h后，将对数期生长的Daoy细胞利用胰蛋白 酶消化法制成单细胞悬液，然后接种于Matrigel胶预处理的96孔板中，每孔加 1X105细胞，并设3个平行孔，分别在孵育30min、60min、90min后用PBS洗 涤以除去未黏附的细胞，采用噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl—tetrazolium，MTT) 比色法检测570nm处的吸光度(A)值并计算粘附率，其公式为粘附率(％)=粘附于 Matrigel上细胞的A值／总细胞A值×100％。 细胞划痕实验：待转染48h后，将对数期生长的Daoy细胞利用胰蛋白酶消 化法制成单细胞悬液并接种于6孔培养板中，待细胞长到完全融合时，用2009L 黄色枪头在6孔板的底面上沿直线轻轻划痕制作细胞伤口模型，PBS冲洗2次 后继续培养，分别于划痕后第8h、16h、24h后在倒置显微镜下观察细胞划痕愈 IIl 万方数据  摘要 合情况并拍照。我们以细胞划痕愈合百分比表???细胞的迁移能力(Oh的细胞划痕 愈合为O％1。 Transwell小室体外侵袭实验：将Transwell小室置于24孔板内，在每个下 室内加入含有10％小牛血清的DMEM培养液500I_tL，上室3ⅡA200rtL细胞悬液， 每组设5个复孔，常规培养12h后取出Transwell小室，利用95％乙醇固定并采 用棉拭子擦去小室内面的基质腔，然后通过4％多聚甲醛固定、HE染色，最后 在显微镜下观察并拍照。 统计分析：应用SPSSl9．0统计软件包对数据进行统计学处理分析，计量资料 以均数4-标准差表示。两组数据间均数比较采用独立样本t检验，多组数据间均数 比较采用One．Way ANOVA分析。计数资料以用百分比／率表示，比较采用卡方 检验。全部数据均进行双边检验，尸0．05为差异有统计学意义。 结果： 1．MTAl蛋白在髓母细胞瘤组织中的阳性表达率高于瘤旁正常组织的阳性表 达率(P0．01)； 2．MTAl一siRNA组中MTAl的表达水平较MTAI-niRNA组及对照组明显降低 (均P0．05)； 3．MTAl．siRNA组中MTAl蛋白量的表达显著低于MTAl．niRNA组及对照组 俨0．05)，而MTAI-niRNA组和对照组的MTAl蛋白表达量无明显差异p0．05)； 4．MTAl。siRNA组中细胞黏附率显著低于MTAl。词埘A处理组及对照组细胞 黏附率(火0．05)，而对照组及MTAl一niRNA组细胞粘附率差异无统计学意义(P 0．05)； 5．与对照组及MTAl一niRNA组相比，MTAl．siRNA组细胞的划痕愈合速度较 慢，并出现未完全愈合现象； 6．MTAl一siRNA组中穿过Transwell小室基底膜细胞数量明显低于 MTAl一niRNA组及对照组(尸0．05)，而对照组和MTAl一niRNA处理组穿过基底 膜细胞数目之间无明显差异(PO．05)。 IV 万方数据  硕士学位论文 结论： 髓母细胞瘤中MTAl蛋白表达水平升高，而且，抑制MTAl的表达可以降 低髓母细胞瘤细胞的转移、侵袭及黏附能力。因此，MTAl可作为临床上治疗人 髓母细胞瘤潜在的靶点。 关键词：肿瘤转移相关蛋白1；髓母