HIV1 MA蛋白的表达纯化及疫原性的初步研究.docx

__——————————————————————————————一。 __——————————————————————————————一。!兰塑至 ．一—— 中文摘要 HIV-1基质蛋白在病毒的组装、出芽等方面起重要的作用。而且比较保守， 变异发生率低，而且是细胞免疫应答的靶抗原，能够产生较好的免疫效果。 本研究以保藏菌株质粒pNL4．3为模板，在引物设计时加入TAA终止密码 子，通过聚合酶链式反应扩增获得艾滋病病毒MA蛋白编码序列，含有399 bp， 编码132个氨基酸残基，蛋白质分子量大约为17 kD，等电点为9．27。把带有 相应酶切位点的MA编码序列克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)qb，构建了 重组表达载体pET-28a．ma，经PCR鉴定、双酶切鉴定以及测序分析证实重组质 粒正确。将该重组质粒转化E．coB BL21(DE3)，37℃时经IPTG诱导后，将菌体 裂解，作聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，与阴性对照实验相比在20 kD附近有一条 特异性蛋白质条带，MA蛋白17 kD融合载体His标签3．56 kD，说明目的蛋白 MA成功表达，大小与预测结果相符。 表达的融合蛋白是可溶的，菌体裂解后存在于上清中。利用金属镍亲和层 析的方法初纯化蛋白。再经过凝胶过滤层析，离子交换层析纯化后可以获得较 纯的蛋白质，经过MALDI．TOF MS鉴定其为带有His标签的MA蛋白。将纯 化后的融合蛋白与免疫佐剂混合后，分四次免疫新西兰雄兔，获得特异性较强 的多克隆抗体，并利用原核表达的融合蛋白制备抗原亲和层析柱对抗体进行纯 化。获得纯度及特异性较好的抗体，用于目的蛋白MA真核表达的鉴定纯化。 在真核方面，把带有相应酶切位点的MA编码序列克隆到供体质粒 pFastBacl中，并且鉴定重组成功；用供体质粒pFastBacl．ma转化DHl0Bac， 通过蓝白斑筛选获得重组的Bacmid-ma，利用PCR的方法和测序鉴定，说明重 组成功。提取重组的Bacmid．ma基因组，用其转染家蚕卵巢上皮细胞，待细胞 发病后；经过PCR鉴定，获得重组有MA编码序列的杆状病毒。发病细胞经过 传代后，用自制的兔多克隆抗体为一抗，Westernblotting鉴定目的蛋白MA在 杆状病毒表达系统中成功表达，并且不带有任何标签。用重组的杆状病毒感染 家蚕五龄幼虫以及蚕蛹，利用Westernblotting也检测到了目的蛋白MA的表达。 利用纯化的多克隆抗体制备抗体亲和层析柱，对真核表达的目的蛋白进行纯化， 经过质谱鉴定，确定其为MA蛋白。 中文摘要用原核表达的MA蛋白与正常的蚕蛹粉提取物混合和真核表达的MA蛋白 中文摘要 用原核表达的MA蛋白与正常的蚕蛹粉提取物混合和真核表达的MA蛋白 的蚕蛹粉提取物，对小鼠进行口服免疫研究，初步探索利用杆状病毒系统表达 的MA蛋白的口服免疫原性。 关键词：MA蛋白，杆状病毒，免疫原性 AbstractAbstract Abstract Abstract The HIV-1 matrix protein(MA)plays a very important role in several stages of the life cycle of HIV-1，including virus assembly and budding．The MA is very conservative SO it is a good antigen． In this study,plasmid pNL4—3，which contains genome of HIV-1，was used as template of PCR．The ORF of protein MA was obtained by adding磁么as ending codon．Protein MA，contains 1 32 amino acid residues with molecular weight of 1 7 kD and isoelectric point of 9．27．The coding sequence of MA was cloned into the E． coli expression vector pET-28a(+)．The recombinant plasmid pET-28a(+)。ma was then transformed into E．coli BL2 1(DE3)and the expression of fusion protein His．MA was induced by IPTG at the temperature of 37℃．which exsited in supernatant．After purificatio