HIV1整合酶S19DE2C融合蛋白的定向整合及其整合位点的预测和分析.docx

浙江大学博士学位论文 浙江大学博士学位论文 中文摘要 中文摘要 本研究有两个主要目的，首先研究HIV．1整合酶通过一定修饰后，在人类基 因组上定向整合的能力，为后续的HIV．1整合位点偏好性研究提供实验依据；其 次使用支持向量机(Support Vector Machine，SVM)的方法，通过对已知HIV一1整 合酶的整合位点附近DNA序列的学--O，建立一个能够有效预测整合位点的生物信 息学模型。 实验方法 1．为了研究HIV．1整合酶的定向整合功能，我们对野生型HIV．1整合酶引入 S119D突变，然后使其与多锌指蛋白E2C融合。该融合蛋白能够特异性地识别人 类基因组上的特定DNA序列位点。融合蛋白通过反式包装(in trans)进入HIV．1 病毒载体，感染细胞后，依次使用生物素引物标记、磁珠富集以及接头介导PCR 等方法，对HIV．1整合酶S1 19D／E2C融合蛋白定向整合位点附近的DNA进行富 集和扩增，最终用454测序获得全基因组上的整合位点信息。 2．为了解决上述实测整合位点实验周期长的弊端，我们对基因组综述序列 (Genome Survey Sequences)数据库中已有的HIV．1整合位点序列进行了整理， 提取最可靠的基因组单一匹配序列作为训练数据集。根据支持向量机的算法，使 用LibSVM、Matlab和自编的Peal脚本程序对训练数据集进行学习、训练，以建 立准确率较高的预测模型，并用于进一步分析。期望通过该模型对HIV．1整合位 点序列的预测，获得HIV．1整合酶修饰特征与定向整合能力间相关性评估数据， 用于指导设计更优化的实测性研究。 结果 1．首先，通过实验证明了在对HIV．1整合酶的修饰并反式包装进入病毒的过 程中，病毒的包装和感染能力没有明显下降，提示其仍保持作为载体的生物学特 征。其次，使用包含不同融合酶及其突变体和融合蛋白的病毒对HEK293T细胞系 进行感染，提取、扩增整合位点序列，进而使用454测序法对相应整合位点的分 析表明：与野生型整合酶相比，整合酶和E2C融合蛋白在基因组上更倾向在“e2c 位点”附近发生整合反应，提示达到了提高在基因组定向整合的能力的预期目标； Il 浙江大学博士学位论文 浙江大学博士学位论文 中文摘要 整合酶S1 19D突变体降低了HIV．1整合位点处对序列的选择性，提示其随机性插 入偏好性可由此得到适当的控制。 2．通过支持向量机的统计学习方法建立了对HIV．1整合位点的预测模型，其 预测准确率达到了82．09％(AUC-o．8678)．具体的建模过程表明，支持向量机 在整合位点预测过程中，训练数据集需要的整合位点数最少在500～1000个。该模 型的预测结果，与实验得到的HIV整合位点序列的特征基本一致。我们不仅预测 到整合反应偏好的序列，还预测到一些整合反应最不偏好的序列，并分别命名为 热点序列和冰点序列。冰点序列目前尚无法通过实验手段得到。 结论 在宏观水平上，借助多锌指蛋白E2C特异性结合DNA的功能，一定程度上 实现HIV．1载体向人类基因组上特定位点的定向整合；在微观水平上，整合酶的 S119D突变降低了整合位点DNA序列上的偏好性．这两个层次的特点在解决 HIV-1对基因组整合位点的选择和可控性上提供了有益的借鉴． 使用支持向量机建立起相应的预测模型，为相关实验的前期设计和分析提供 有效的信息，可以有效地克服现有实验技术和工具的局限性。 关键词：HIV-1，整合酶，E2C蛋白，定向整合，支持向量机 浙江大兰堕主兰垡笙奎 浙江大兰堕主兰垡笙奎 茎兰塑茎 ABSTRACT Our first aim is to construct some fusion proteins of HIV-1 integrase(S 1 1 9D)and polydactyl zinc．-finger protein E2C to perform a targeted integration．The second aim is to establish a support vector machine model to predict the potential integration sites by learning current integration sites obtained by experiments． Methods 1．To study the targeted inte