HLAC克隆 表达及在母耐受作用的初探.docx

上海第二医科土学博士学位论文 上海第二医科土学博士学位论文 中文捕要 HLA—C克隆、表达及在母胎耐受作用的初探 博士研究生：李卫党 导 师：范丽安 上海第二医科大学免疫学研究所 中文摘要 ≮组成的具有高度多态性的遗传复合体，位于人类6号染色体的短臂上。分为 HLA(human leukocyte antigen)复合体，它是一个由一系列紧密连锁的基因座 HLAI类、II类、III类3个基因区。HLAI类基因又分为经典I类基因(HLAIa) 和非经典I类基因(HLA to)。HLA．C基因属于HLA Ia，是最早发现的3个功能 基因之一。HLA Ib发现较晚，包括HLA．E、F、G 3个基因，目前在胚胎种植发 育和肿瘤免疫中研究较多。HLA-C抗原虽已发现多年。但因其有限的多态性及 在细胞表面的表达低于HLA．A、B分子，血清学分型困难。多年以来对其在免 疫系统中的作用研究甚少。直到1990年Moretta及其同事在研究NK细胞杀伤作 用时，直接证实HLA．C分子具有抑制NK细胞细胞毒作用。迸一步研究表明它 是NK细胞表面的杀伤抑制性受体(killer intfibitory receptor，Km)的配体。因而 出人意料地使HLA．C成为免疫系统中一个值得关注分子，并使NK细胞受体研 究取得重要突破性进展。与此同时，在研究母胎界面滋养层细胞分子表达时发现， 它虽不表达经典的HLA-A、．B及全部的HLA II类分子，却表达经典的HLA-C 和非经典的HLA．G、E分子。HLA．c分子这～特殊表达，提示它可能通过与子 宫NK细胞之间的相互作用在维持母胎耐受中起重要作用。以往的大部分研究都 是将HLA．C分子表达在B淋巴母细胞系LCL722．721上进行的。为了更能反映 它在母胎界面的真实情况万本课题试图以滋养层细胞表达HLA-C为模型，对其 功能进行研究。为此克隆了HLA．C基因，并将它表达在HLA I类分子阴性的JAR 细胞上，从以下几方面初步探讨了HLA．c分子的生物作用． 第一部分 HLA_c l目l棱细胞毫琏麓俸的相慧、薹定反表达 为研究滋养层细胞表达HLA-C分予的生物学作用及它与NK细胞受体之间 的相互作扇：龟们 从一健康汉族个体的外周血单个细胞中直接克隆了 HLA．cw+0602轴， 构建pcDNA3-HLA-c真核表达载体，在HLA I类分子阴性 -l- 上海第二医科文学博士学位论文 上海第二医科文学博士学位论文 中文摘要 —————————_、———_—————，———，——_——————————_————————————-———--——_-———_————————————一—— 的滋养层细胞来源的绒癌细胞系JAR细胞表达。并获得了高表达HLA-C分子的 JAR细胞(78％1。由于HLA-A、B基因和HLA．C在它们的cDNA两端高度同源， 我们在扩增HLA．C基因时，发现HLA．A、B基因也可同时被扩增。为进一步研 究NK细胞受体与HLA I类分子之间的相互作用，我们也克隆了}ⅡA-A’3001 和HLA-B*27052基因。) 第二部分HLA-C细胞表面表达对RSA庸人外月血Nl【细胞功艇的影响 利用直接分离的外周血NK细胞对JAR细胞和表达HLA-C的JAR细胞进行 细胞毒试验，结果直接分离的NK细胞对两者都无细胞毒作用X为获取纯度相对 较高的NK细胞，我们在体外用PHA、rlL-2扩增初步分离纯化的NK细胞，结 果CD56+的NK细胞获得了不同程度的扩增(48，20～70．90％)，并表达不同程度 的KIR2D受体f35．06％．63．38％)。正常人和RSA病人体外扩增的NK细胞对JAR 细胞、JAR-HLA．Cw*0602细胞均有细胞毒活性。用EB6单抗阻断NK细胞抑制 性受体，rlL-2活化的NK细胞仍对靶细胞有杀伤作用。与正常对照相比RSA病 人NK细胞对靶细胞的细胞毒作用未见著性差异(Po．05)。对正常人和RSA病 人体外扩增的NK细胞与靶细胞作用4小时和20小时时，收集细胞上清进 行IFN-y的检测，结果显示表达HLA-C分子的JAR细胞与RSA病人NK细胞 作用后，其NK细胞分泌的IFN-丫与同JAR细胞作用后分泌的IFN--／无明显差异。 但两者在20小时时分泌的IFN-Y水平都明显高于4小时时分泌的量口o．01)。同 正常人NK细胞相比RSA病人NK细胞产生的IFN-7无明显变化。结果表明 HLA．C分子在JAR细胞表面表达未能抑制活化NK细胞的细胞毒作用及IFN吖 的分泌。活化NK细胞对JAR细胞的杀伤存在mA．C分子非依赖的机制。丫 第三部分HI