HMGCoA原酶抑制剂对INS1细胞RasRafERKCREB信号转导通路的影响.docx

天津医科大学硕士学位论文中文摘要 天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 目的胰岛素抵抗和胰岛p细胞胰岛素分泌功能受损是2型糖尿病发病的两个 最重要的病理生理机制。如何最大限度地保护胰岛D细胞功能，避免糖尿病患 者因使用其它药物而导致本已受损的B细胞功能进一步恶化，一直是医学界关 注的焦点。目前已经证实，多种临床药物均可影响胰岛B细胞功能，影响胰岛 素分泌，进而影响糖代谢。 阿托伐他汀作为HMG．CoA还原酶抑制剂，以其明确的调脂疗效和较好的 耐受性而广泛应用于糖尿病患者，且时间窗越来越早、应用时间越来越长、剂 量越来越大。该类药物的调脂外作用也日益受到关注，其中包括对糖尿病的影 响。近来多项临床荟萃分析发现他汀类药物使糖尿病的患病风险增加，且呈药 物剂量依赖性，但具体机制尚不清楚。体内外研究证实，HMG．CoA还原酶抑 制剂除具有良好的降低胆固醇水平作用外，还可通过抑制胰岛B细胞ATP敏感 K+通道和电压依从性钙通道活性而抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌，通过抑制胰 岛素启动子活性而抑制胰岛素mRNA表达。但HMG．CoA还原酶抑制剂通过何 种具体机制抑制胰岛素启动子活性进而抑制胰岛素合成目前尚未见相关研究报 道。 HMG．CoA还原酶抑制剂通过抑制甲羟戊酸代谢产物如焦磷酸法呢酯 (FPP)、焦磷酸龙牛儿基龙牛儿醇(GGPP)的合成，使依赖FPP、GGPP修饰的小 GTP蛋白如Ras和Rho不能定位于细胞膜，从而抑制细胞内信号传导。 Ras／Ra纯R刚CI也B信号通路是目前比较明确的胰岛素信号通路，主要参与胰 岛素的基因转录调控。由此，HMG．CoA还原酶抑制剂与Ras／Raf／ERK／CREB 信号通路的关系值得深入探讨。本研究观察高糖刺激下阿托伐他汀干预后胰岛 p细胞株INS．1细胞Ras／Ra砸砌√CREB信号通路中各个关键激酶活性的变化以 及细胞核转录因子CREB／DNA结合活性，以明确阿托伐他汀对Ras信号转导通 路分子水平变化的影响，探讨他汀类药物抑制胰岛p细胞胰岛素启动子活性， 进而抑制胰岛素mRNA表达的作用机制。 方法 以胰岛B细胞株INS．1细胞为模型，体外观察阿托伐他汀对INS．1细胞 Ras复合体途径中(Ras瓜a饱龇REB)的影响。本实验分别采用Western blot、 RT．PCR方法检测阿托伐他汀对胰岛素信号转导通路中的Ras复合体途径中各 天津医科大学硕士学位论文关键酶(RasGTPase、p-Raf-1、p-CERB)活性变化。采用染色质免疫共沉淀法 天津医科大学硕士学位论文 关键酶(RasGTPase、p-Raf-1、p-CERB)活性变化。采用染色质免疫共沉淀法 检测阿托伐他汀对INS．1细胞p-CREB／DNA结合活性的影响。 结果 (1)高糖(25 mmol／L)诱导INS．1细胞Ras通路蛋白活性增加，且呈时间依 赖性。实验结果显示高糖组磷酸化Raf-1激酶表达水平与正常组比较明显增高， 随着时间的延长，磷酸化水平逐渐增加，2小时表达开始增高，64,时增高明显， 达对照组的2．4倍，而对Raf-1的蛋白总量影响不大。 (2)阿托伐他汀呈浓度依赖性抑制INS．1细胞Ras通路中关键因子蛋白 p-Raf-1的活性。不同浓度阿托伐他汀处理细胞24h后，随着阿托伐他汀浓度增 加，磷酸化Raf-1表现为明显抑制，表达量逐渐减少。与对照组相比，P—Raf-1 表达水平在19mol／L及109mol／L时下降不明显(尸0．05)，在509mol／L时出 现明显降低(尸O．01)，在1009mol／L时阿托伐他汀组中出现较强的抑制(尸 O．01)。 (3)501amol／L阿托伐他汀抑制INS．1细胞Ras通路中关键因子蛋白的活 性。INS．1细胞经高糖(25 mmol／L)刺激6小时后加用509mol／L阿托伐他汀 处理，经Western bloting检测显示，与高糖组相比，阿托伐他汀组Ras GTPase、 p-Raf-1、P．CREB的蛋白表达水平均明显下降，抑制率分别为61．8％、60．9％、 55．4％(P0．01)。 (4)本实验在基因水平检测发现各关键酶表达没有变化，高糖组Ras mRNA表达与对照组相比变化不明显，与同浓度葡萄糖组相比，阿托伐他汀组、 RasGTPase抑制剂Manumycin A组Ras mRNA表达无明显变化(胗O．05)。 (5)阿托伐他汀抑制INS．1细胞p-CREB／DNA结合活性。与对照组相比， 高糖刺激后INS．1细胞p-CREB／DNA结合量明显增高。与高糖组相比，阿托伐 他汀药物处理组及Manumycin A组P—CREB／DNA结合量均明显下降(尸 O．01)。 结论 (1)体外高糖能明显诱导胰岛13细胞株INS—l细胞Ras／Raf／ERK