HMGB1LP介导的自噬凋亡失衡在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞致病理损伤中的作用和机制.docx

HMGBl．LPS介导的自噬／凋亡失衡在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞致病理损伤中的作用和机制 摘要 目的：初步探索高迁移率蛋A 1(High Mobility Group Box Chromosomal Protein l。HMGBl)一脂多糖(LipopolysacLcharide，LPS)复合物诱导类风湿关节炎滑膜成 纤维细胞(Rheumatoid Arthritis Synovial Fibroblasts，RASF)自噬(autophagy)水平 上调在类风湿关节炎(RheumatoidArthritis，RA)发生发展中所起到的作用，及其分 子机制，为RA的临床诊治提供新的干预靶点。 方法：我们采取体外体内实验相互验证的方法，深入探讨了HMGBl一LPS复合物 在诱导RASF发生自噬过程中所起到的分子机制，本研究分为两个部分： 第一部分：收集骨关节炎(Osteoarthritis，OA)和RA病人关节滑膜石蜡切片病 理标本，分别用免疫组化方法检测HMGBl、自噬相关蛋白5(Autophagyrelated gene product 5，At95)、BECN编码蛋A 1(Beclinl)、微管相关蛋A质轻链3(microtubule —associatedprotein．1ightchain 3，LC3)分子在RA和OA滑膜组织中的表达情况。应用 Real—time PCR的方法检测OA和RA病人关节滑膜组织自噬相关基因(Beclinl，At95， LC3)mRNA的相对表达水平。采用荧光Tunel法分别检测骨关节炎滑膜成纤维细胞 (Osteoarthritis Synovial Fibroblasts，OASF)和RASF的细胞凋亡情况。分析患者病 理切片的染色阳性细胞比例和阳性的强弱，可得到两组患者病损关节滑膜组织免疫组 化的评分结果。分析RASF和OASF间HMGBl、自噬和凋亡相关分子的表达差异， 以及这些分子表达情况与病人疾病活动度指标【C型反应蛋白(C—reactive protein， CRP)、类风湿因子(RheumatoidFactor，RF)、环瓜氨酸肽抗体(anti—cyclic cirullinated peptide antibodies，CCP抗体)、红细胞沉降率(Erythrocyte Sedimentation Rate，ESR)] 间的关系。 第二部分：将RASF传代培养于六孔板中，待细胞融合度达80．90％之间即可开 始实验。按照空白对照组、HMGBl刺激组、LPS刺激组和HMGBl．LPS复合物刺激 组依次向各处理组加入刺激剂，继续培养48小时后收集各处理组蛋白。蛋白质印迹 法(Westem Blot，WB)检测LC3 I和LC3 II的表达变化和灰度比值的数量变化，同 时检测Beclinl的变化；细胞免疫荧光染色观察各处理组Beclinl和At95的表达情 况；透射电镜观察各刺激组RASF自噬情况；采用细胞凋亡检测试剂盒(FITC—Annexin 万方数据  第二军医大学硕士学位论文 V／PI染色法)和流式细胞仪检测各组RASF细胞的凋亡率；用WB检测Bax、Bcl一2 的表达。流式细胞术检测经HMGBl一LPS刺激的RASF细胞表面Toll样受体一2(Toll． 1ike receptors2，TLR一2)、Toll样受体．4(Toll—like receptors4，TLR一4)和糖基化终产 物受体(Receptor for advanced glycation endproducts，RAGE)的表达变化。设计针对 TLR一2、TLR一4和RAGE三个受体的siRNA，观察siRNA抑制各受体后，HMGBl一 LPS刺激RASF的自噬表现。PathScan Akt signaling antibody array kit筛选可能激活的 信号通路，再进一步采用WB验证蛋白芯片初筛的结果。采用免疫化学发光法定量检 测培养上清液中的IL一1 B、IL．2受体、IL．6、IL一8、IL一10以及TNF一0【的水平。 结果： 1、纳入研究的RA组和OA组病人临床资料。 非选择性地将20例RA病人和16例OA病人纳入研究。RA组病人血清学疾病 活动度相关指标ESR和CRP水平均显著高于OA组病人，且纳入的20例RA患者 的血清CRP全部高于8mg／L，其中18例(90％)ESR高于20mm／h；CCP抗体的阳 性率高达90％，浓度范围为25—273．01 RU／ml；RF的阳性率为95％，浓度范围为25— 143．3 KIU／L，均显著高于OA组病人。 2、RA病人关节滑膜组织自噬相关蛋白和HMGBl的表达水平显著高于OA病人。 为明确RA和OA病人关节滑膜组织自噬相关蛋白和