hparp1基因在细胞损伤效应及适应性反应中作的研究.docx

中山大学陴十学位论文唐焕文：hPARP一1基阁在细胞损伤效应及适应性反应中作用的研究中文摘要应普遍存在于易感和正常群体，且具有相似性，但有足够的证据证实仍存在缺乏 中山大学陴十学位论文唐焕文：hPARP一1基阁在细胞损伤效应及适应性反应中作用的研究中文摘要 应普遍存在于易感和正常群体，且具有相似性，但有足够的证据证实仍存在缺乏 这种低剂量刺激反应能力的细胞株或个体。这种资料非常有限，但对于研究兴奋 性效应是极为有用的。因此，具有兴奋效应这种能力是影响个体对异生性化合物 具有不同易感性的因素之一，在有害因子的危险度评价中具有重要意义。 人类对环境污染物的接触一般是长期低剂量的，机体对于这种接触的应答显 然有别于实验条件下的大剂量接触。而目前对低剂量条件下机体的耐受和适应研 究较少。hPARP一1被低剂量化学物激活，能作为一个信号分子调控转录因子的表 达，促进断裂DNA的修复，从而使细胞对后继大剂量化学物攻击产生耐受。 本课题运用分子生物学手段构建反义RNA重组质粒表达载体，并转染真核 细胞，建立hPARP．1缺陷细胞株；初步探讨hPARP—l蛋白正常及缺陷对不同剂 量MMS和HQ毒作用影响及hPARP．1与适应性反应的关系。为研究hPARP-l 基因功能及在高剂量下的遗传毒作用和低剂量ECPs接触时参与适应过程的细胞 与分子机制提供理论依据。 方法： 1．hPARP．1反义RNA真核表达载体构建 抽提HLF细胞总RNA，通过逆转录．聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增cDNA 保守区域片段，T载体克隆后，用基因工程的方法，将该片段反向插入绿色荧光蛋 白表达载体，构建反义RNA表达载体。并测序确证。 2．hPARP．1蛋白缺陷细胞株建立 运用真核细胞转染的方法，将反义RNA表达载体转入HLF细胞，建立 hPARP．1蛋白缺陷细胞。通过荧光显微镜观察转染成功，用蛋白免疫印迹法检测 3种细胞hPARP．1蛋白表达情况，确定反义抑制效果。 3．hPARP．1蛋白缺陷细胞生物学性状研究 通过观察转染细胞生长形态、超微结构、生长特性、细胞周期及软琼脂培养 生长状况等生物学特性，了解转染细胞恶性程度情况。 4．hPARP．1蛋白缺陷对甲基甲磺酸、氢醌遗传毒作用影响的研究 II 中山大学博}学位论文唐焕文：hPARP．1基闻在细胞损伤效应及适应悱反应中作用的研究中殳摘要以hPARP—l蛋白缺陷细胞株为模型，用标准断裂剂甲基甲磺酸和氢醌染毒， 中山大学博}学位论文唐焕文：hPARP．1基闻在细胞损伤效应及适应悱反应中作用的研究中殳摘要 以hPARP—l蛋白缺陷细胞株为模型，用标准断裂剂甲基甲磺酸和氢醌染毒， 从微核形成率及核异常率、细胞周期及DNA断裂等方面测定细胞遗传毒性，以 研究hPARP．1蛋白功能及其缺陷细胞对甲基甲磺酸、氢醌毒作用的影响。 5．hPARP一1基因在细胞适应性反应中作用的研究 用低剂量MMS、HQ预处理细胞后，观察细胞和DNA对大剂量MMS、HQ 攻击的适应性反应，从微核率及核异常率、细胞周期及DNA断裂等方面测定细 胞变化情况，探讨hPARP一1蛋白对细胞适应性反应的影响。 6．hPARP一1基因民族多态性研究 采用PCR-SSCP的方法，筛查不同民族898名正常人中hPARP一1基因外显 子3、1 l、12、13、16、17、20可能存在的多态位点，为民族基因多态性研究提 供资料。 结果： 1 hPARP．1基因反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体的构建 在Genbank中查找到人PARP．1基因eDNA序列并设计引物，在上、下游引 物5、端分别引入BamH I和Xho I酶切位点，并确定目的序列中没有这两个位点。 抽提HLF细胞总RNA，经二步法RT-PCR扩增，获得397bp含hPARP-1 eDNA 保守区域的目的片段。 将RT—PCR产物与pMDl8．T载体连接，转化感受态DH5 n细菌，挑选白色 菌落，扩大培养后抽提质粒DNA。用BamH I和Pst I对重组质粒进行单酶切及 双酶切和PCR鉴定。用T载体上的M13通用引物进行测序。与Genbank内 hPARP—l基因cDNA相比，测序结果的符合率达99．O％，证实为hPARP一1基因 eDNA片段。同时成功构建重组质粒，并命名为‘pMDl8-T—P”。 pEGFP．CI及重组T载体分别经BamH I和Xho I双酶切后，回收目的片段， 将hPARP．1基因eDNA保守区域目的片段和双酶切的pEGFP-C1连接，转化感 受态DH5 a细菌，在卡那霉素的平板上筛选阳性菌落，扩增后抽提重组质粒 DNA，用BamH I和Xho I进行单、双酶切鉴定，并用RT-PCR引物进行双向测 序。结果表明，hPARP．1基因eDNA片段已成功地反向插入pEGFP-C