试验三DNA的酶切.PPT

实验原理 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。 Ⅱ类限制性内切酶 Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割, 产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ: 5‘-CCC↓GGG-3’)；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性末端，如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 5…G↓AATTC…3 →5… G AATTC…3 3…CTTAA↑G …5 →3… CTTAA G…5 实验材料和试剂 实验材料： 玉米基因组DNA 实验试剂： BamH I 酶及其酶切缓冲液：购买成品。 SalI酶及其酶切缓冲液：购买成品。 琼脂糖(Agarose)：进口或国产的电泳用琼脂糖均可。 实验仪器 对质粒DNA酶切反应 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶, 消化1-2h。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。 电泳检测示例 实验注意事项 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶，消化1-2h。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。 酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。 许多实验制备的DNA不易于降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。 市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1×）进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则酶活性将受影响。 思考题 如果一个DNA酶解液在电泳后发现DNA未被酶切或者酶切不完全, 你认为可能是什么原因？ * * 实验三 DNA限制性内切酶 消化酶切 限制性内切酶 酶分子 识别位点 切割位点 限制作用是否需用 ATP Ⅰ类 三亚基双功能酶 二分非对称 至少在识别位点外 1000bp Yes Ⅱ类 内切酶与甲基化酶分子不在一起 4-6bp, 大多数为回文对称结构 在识别位点中或靠近识别位点无特异性 No Ⅲ类 二亚基双功能酶 5-7 bp 非对称 在识别位点下游 24-26bp Yes 限制性内切酶可分为三类 恒温水浴锅 用手指轻弹管壁使溶液混匀，使溶液集中在管底 混匀反应体系后，37℃水浴保温2-3h 电泳检测 EP管编号 实验步骤 反应体系 20μL酶液 DNA 15μL BamHⅠ 1μL SalⅠ 1μL 10×BufferT 3μL *