层析分离技术.pptx

色谱分离方法;2;色谱法的发展; 1956年Van Deemter等在前人研究的基础上发展了描述色谱过程的速率理论，1965年Giddings总结和发展了前人的色谱理论，为色谱的发展奠定了理论基础。;如今，色谱法不仅用于有色物质的分离，而且大量用于无色物质的分离。所以色谱法已经失去原来的含义。但是，现在仍沿用色谱法这个名称。 色谱法具有分离及分析两种功能。它是分析混合物最有力的手段。 色谱分离是目前应用最广泛的分离方法。已广泛地用于石油化工、有机合成、生理生化、医药卫生、环境监测、刑事侦查、生产在线控制，乃至空间探索等许多领域，以解决各种分离分析课题。 ;什么是色谱法？; 两种组分的理化性质原本存在着微小的差异，经过反复多次地吸附→解吸→再吸附→再解吸的过程使微小差异累积起来，结果使吸附能力弱的组分先流出色谱柱，吸附能力强的组分后流出色谱柱，从而使各个组分得到了分离。;包括两相（即固定相、移动相）和样品。 固定相 在色谱过程中不发生移动。 材料：固体（相）、固体及其所支持的液体。 流动相 在色谱过程中不停地移动，并带动被分离物质一起移动。 材料：气体、液体。 样 品 溶质;9;10;色谱法的分类（依据不同,分发不同）;开床式色谱;（3）按分离原理分类;（4）按使用领域不同对色谱的分类：;色谱分离的基本原理;色谱法的基本原理;下图为一二元组分分离示意图。;分 离 原 理; 离子交换色谱法; 与离子交换法的区别？ 离子交换法：应用离子交换剂作为吸附剂，通过静电引力将溶液中带相反电荷的物质吸附在离子交换剂上，然后用合适的洗脱剂将吸附物从离子交换剂上洗脱下来，从而达到分离、浓缩、纯化的目的。 ;一、基本原理;离子交换的基本过程：;a; 离子交换树脂是一种不溶于酸、碱和有机溶剂的固体高分子聚合物。它具有网状立体结构并含有活性基团，能与溶剂中其他带电粒子进行离子交换或吸着。;交换树脂表面;操作方法;上样;3.洗脱;发展趋势;凝胶色谱法;一、基本原理;凝胶过滤层析过程示意图;二、凝胶过滤介质;三、操作方法;2. 层析柱的选择;3. 凝胶柱的装填;4. 样品处理和加样;4. 样品处理和加样;5. 洗脱与收集;6. 凝胶的保存;发展趋势;亲和色谱;①选择性高、特异性极强 ②操作条件温和 ③回收率高 亲和色谱的局限性 ①普遍性、通用性不够 ②费用高;;亲和层析过程;操作方法;5 操作方法;5 操作方法; 5 操作方法;5 操作方法; 5 操作方法; 5 操作方法;发展趋势;疏水色谱;利用样品中各组份与色谱填料上配基相互作用力的差异, 在洗脱时由于各组份移动速度的不同而达到分离的目的. 配基通常是一些疏水性基团, 如丁基、苯基等. 蛋白质表面多由亲水性基团组成, 也有一些由疏水性较强的氨基酸组成的疏水性区域.不同种类蛋白质的表面疏水性区域多少不同,疏水性强弱也不同;对于同一种蛋白质在不同介质中,其疏水性区域伸缩程度也不同,从而使疏水性基团暴露的程度呈现出一定的差异。 疏水相互作用色谱法正是利用盐-水体系中样品组份的疏水性基团和色谱填料的疏水性配基相互作用力的不同而使样品组份得以分离的. ;盐种类和浓度的影响　 有些盐(如Na2SO4, (NH4)2SO4等)可以提高蛋白质的稳定性, 使其溶解度下降, 对蛋白质有盐析效应, 使蛋白质与固定相的疏水作用增强; 有些盐(如MgCl2) 虽然能增加溶剂表面张力, 但同时也增加蛋白质的溶解度, 并不能增强蛋白质与色谱填料的相互作用. 盐的种类不同, 不仅影响着蛋白质在色谱柱上的保留行为, 同时也影响着蛋白质分离纯化的效果. ;平衡液及样品中的高盐浓度能促进蛋白质与配基的相互作用，在一定盐浓度范围之内, 蛋白质的吸附量与盐浓度成线性关系。 被吸附的蛋白质可以通过降低盐浓度而被洗脱下来。 ;盐浓度越高，吸附容量越大； 盐析效果越显著，影响越大;pH 对疏水色谱的影响　 pH 的改变必然改变蛋白质的电荷性质及电荷量，从而影响蛋白质与色谱填料间的静电相互作用，也影响蛋白质在色谱柱上的保留行为。 由于每一种蛋白质在某一特定pH 条件下，其空间构象、所带电荷情况不一致，因此，pH 对蛋白质在色谱柱上保留行为的影响具有一定的复杂性。某些情况下影响较小，有时改变pH可促进洗脱。;柱温对疏水色谱的影响　 疏水相互作用是一吸热过程，增加温度可以提高蛋白质与配基间疏水相互作用力；因此，增加柱温有利于蛋白质的吸附，保留值增加；但同时温度上升易使蛋白质变性失活。;添加剂对疏水色谱的影响　 在疏水色谱的