人废弃胚到胎单卵裂球体外发育研究-化学工程与技术专业毕业论文.docx

西南交通大学硕士学位论文主要工作(贡献)声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是在导师指导下独立进行研究工作所得的成 西南交通大学硕士学位论文主要工作(贡献)声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是在导师指导下独立进行研究工作所得的成 果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰 写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明。 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 本学位论文的主要创新点如下： 本研究主要对捐赠的解冻后第三天冷冻胚胎经过激光去除透明带，通过细玻璃针 挤压，然后获得胚胎单个卵裂球，将单个卵裂球置于不同培养条件下进行培养(培养 条件包括：微滴大小、培养时间、液体平衡时间及细胞因子作用)，并标记为DO。 此后6天依次为D1～D6，每天观察细胞的发育情况并记录，得出了单卵裂球最佳的体 外培养条件：微滴体积20“l、培养时间是D3、液体在解冻前20小时配置。 对人捐赠的第三天冷冻胚胎解冻，经过激光除透明带，使用细玻璃针挤压，然后 获得胚胎单个卵裂球，在最佳培养条件下，向培养液中添加不同浓度重组人的粒细胞 ．巨噬细胞集落刺激因子(rhGM．CSF)，将获得的单个卵裂球转移至前一天配制好的 囊胚培养液中，并标记为DO。此后3天依次为DI～D3，每天观察细胞的发育情况并 记录；获得囊胚后，用多聚甲醛将囊胚固定，Hoechst33342法对囊胚染色，最终确定 囊胚细胞数目；培养液在最佳培养条件下，添加0．4ng／ml的rhGM．CSF不仅促进了单 卵裂球的分裂，也促进囊胚的形成以及囊胚细胞数的增多；外源细胞因子添加到培养 液中，应用于劣质废胚，rhGM．CSF的添加显著提高了劣质胚胎单卵裂球的分裂率和 囊胚形成率，为胚胎分割的进一步应用提供实验依据。 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是在导师指导下独立进行研究工作所得的成 果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰 写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明。 本人完全了解违反上述声明所引起的一切法律责任将由本人承担。 ≠ 学 位 沦 文 作 者 签 名 日 期 ，留加 三伤钆 6吖 万方数据 西南交通大学硕士学位研究生论文 西南交通大学硕士学位研究生论文 第1页 摘要 对胚胎卵裂球拆分，形成单卵裂球并培养获得妊娠在动物实验中已有报道【卜2】。 由于早期胚胎具备全能性，因此从胚胎中分离单个卵裂球使其细胞数增多甚至发育成 囊胚成为可能。胚胎分割成为卵裂球后培养获得的囊胚和分割前的胚胎相比，具备了 相同的基因组信息，体外培养获得的新的胚胎，移植后获得的个体基因型必然完全相 同，如果发育顺利，就可以凭借这种方法得到与分割前胚胎基因型完全一致的个体， 也就实现了以有限的资源而获得大量的扩增。粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子在雌性 动物的生殖道内合成，并且与啮齿动物、家畜等移植前胚胎的生长发育密切相关，动 物实验提示粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子可以作为胚胎继续发育的“存活因子”。 小鼠移植前的胚胎可表达GM—CSF受体的Q一链，向培养液中加入重组粒细胞一巨噬细 胞集落刺激因子对小鼠卵裂期胚胎生长发育、囊胚的形成以及后续的贴壁粘附有利 [3-71。因此卵裂球的体外培养成为实现上述资源扩增的基础，本研究首先以捐赠的胚胎 为基本材料，探讨了培养液配置时间、卵裂球培养时间、液滴的体积对卵裂球发育能 力的影响，从而得到了此时卵裂球的最佳培养条件，然后在此条件下，以冷冻胚胎为 材料，获得了最适的重组粒．巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor，rhGM．CSF)浓度，最后以此最适细胞因 子浓度的培养液为基础，对来源于捐赠的新鲜第三天劣质胚胎的单卵裂球培养，并获 得良好效果。最佳卵裂球体外培养条件的得出，为后续干细胞培养以及干细胞建系等 提供了前期的实验基础。 为得出最佳的卵裂球体外培养条件，将解冻的120个优质胚胎采用激光破除透明 带后，获得863个卵裂球，单独培养至第六天。(探讨微滴体积lOul、20ul、30ul、40ul 对卵裂球后期发育的影响(40个胚胎，339个卵裂球)。(探讨培养液平衡时间分别 为2h、4h、20h、24h对卵裂球后期发育的影响(40个胚胎，334个卵裂球)。(探讨 卵裂球的培养时间分别为D3、D4、D5、D6对卵裂球后期发育的影响(40个胚胎， 340个卵裂球)。比较各组的单卵裂球分裂率、致密化率和囊胚形成率。探讨卵裂球 的培养时间对卵裂球发育的影响时，还需另讨论培养至最后一天剩余的囊胚数。结果 依卵裂球体外培养形成囊胚