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病毒包装与感染 病毒载体系统 病毒载体的优势 利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高； 病毒的宿主范围广，且具有高效的靶向特异性； 病毒基因组的结构简单、分子背景比较清楚，稳定易于改造、易于制备； 复杂的装配过程由细胞完成； 不同的病毒载体具有不同的表达特点； 通过载体改造的方式形成了复制缺陷型结构，安全性高； 病毒包装技术经历了多年的研究，已趋于成熟，可用于产业化大量生产 存在的问题 1、安全性：细胞毒性 染色体毒性 免疫毒性 2、靶向性：转导靶向性 转录靶向性 3、有效性：转导效率 基因表达水平和持续时间 表达的可调控性 要求：1、携带外源基因并能包装成感染性病毒颗粒 2、介导外源基因转移和表达 3、对机体不致病 组成：1、病毒复制和包装元件 2、病毒基因 3、插入的外源基因或元件 4、病毒外壳/外膜 常用的病毒载体： 腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体 被包装的DNA/RNA中不含任何病毒编码基因，只保留其复制和包装所必需的顺式作用元件。获得的重组病毒颗粒具有野生型病毒的外壳/外膜和感染性，但不表达病毒蛋白 腺病毒载体 无包膜的线状双链DNA病毒，宿主范围很广，适用于在分裂或非分裂哺乳动物细胞中进行高效瞬时表达。 除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞，腺病毒系统可以在任何哺乳动物细胞中高效瞬时表达，是可靠的基因递送平台。它在感染宿主细胞时，病毒基因组及其携带的外源基因独立于宿主基因组外游离表达，因此是无插入突变性，安全性高。 腺病毒载体的外源基因装载量较大，表达速度快，可获得高滴度的病毒。可产生108 pfu/ml原液，浓缩后可达1010-1011VP/ml ，被广泛应用于基础研究和基因治疗中。 腺病毒系统的包装 目的基因克隆至腺病毒穿梭质粒（Pshuttle-CMV） 将穿梭质粒线性化后与腺病毒质粒共转入特定的大肠杆菌中 通过Cre/loxP系统的作用进行同源重组，产生重组腺病毒颗粒。 将筛选到的重组腺病毒运用脂质体法转染到293细胞中，利用带有E1 基因的293 细胞作为包装细胞，一至两周即可包装出E1缺失的腺病毒载体，通过倍比扩增，富集病毒颗粒。 慢病毒载体 慢病毒(lentivirus)属于逆转录病毒科(Retrovidae)，为RNA 病毒。 慢病毒核蛋白质前整合复合物具有嗜核特性，病毒基因组通过顺式作用元件运输至细胞核，并将要表达的基因序列整合到细胞的基因组中，从而使慢病毒可以感染并在非有丝分裂细胞中复制,得到持续稳定的高表达。 这一特性使慢病毒成为基因治疗的转移载体。 慢病毒载体的特性 慢病毒载体由慢病毒为骨架改造而来 可以高效率将目的基因整合到宿主细胞的染色体上 可以感染分裂细胞和非分裂细胞 是理想的可以在多种细胞类型（如原代细胞、干细胞和非分裂细胞）中实现可重复的稳定表达的基因表达工具 常见的慢病毒包括人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)、猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus, SIV)、马传染性贫血病毒（Equine infectious anemia virus,EIAV ）和猫免疫缺陷病毒（Feline immunodeficiency virus,FIV ）。 HIV-1 HIV-1为单链RNA病毒，共有9个基因。gag、pol、env3个基因编码病毒的基本结构，tat、rev为调节基因，vif、vpr、vpu、nef 4个为辅助基因，编码的蛋白则作为毒力因子参与宿主细胞的识别和感染。 慢病毒载体系统组成 第一代慢病毒载体系统是以三质粒系统为代表。该系统由包装质粒、包膜质粒及载体质粒3种质粒组成。 包装部分HIV-1前病毒基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用元件, 5’端LTR由巨细胞病毒早期启动子取代，3’LTR由SV40 polyA序列取代。 三代慢病毒载体 第二代慢病毒载体系统是在第一代的基础上进行改进 在包装质粒中删除了HIV的所有辅助基因（vif、vpr、vpu和nef） 不影响病毒的滴度和感染能力，同时增加了载体的安全性 第三代慢病毒载体系统由四质粒代替原有的三质粒包装系统。 将rev基因单独放在一个包装质粒上。 增加了两个安全特性：一是构建自身失活的慢病毒载体，即删除了U3区的3′LTR，使载体失去HIV-1增强子及启动子序列；二是去除了tat基因，用异源启动子序列代替，只保留了3个基因(gag、pol和rev)，更加安全。 逆转录病毒载体 逆