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人白介素24基因重组腺病毒载体的构建与鉴定-外科学瘤(整形)专业毕业论文.pdf
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作者签 日期:2生垒翌:笸二二f
导师签 日期:.Z翌堕二箜二三;
人白介素24基因重组腺病毒载体的构建与鉴定 中文摘要
【目的】
病理性瘢痕包括增生性瘢痕与瘢痕疙瘩,其形成过程受到各种因素的影响。 一般认为它们是由创伤引起,以成纤维细胞的过度增生及胶原等大量细胞外基质 的过度产生和沉积为特征的皮肤纤维增生性疾病。病理性瘢痕的发病机理至今不 甚清楚,但以往大量研究表明瘢痕的过度增生与细胞因子、癌基因和免疫反应等 密切相关。越来越多的研究表明人白介素24(interleukin 24.IL一24)具有重要的 免疫系统调节功能,对肿瘤细胞具有选择性生长抑制和诱导凋亡作用。重组腺病
毒载体是目前应用最广泛的生物病毒载体之一,与其他病毒载体系统比较,具有 明显优点:能将外源基因高效导入哺乳动物细胞;其转染不依赖细胞分裂,既可 转染分裂期细胞,又可转染非分裂期细胞;携带的外源基因不与宿主基因整合, 对人致病性低。这些优点使其成为一种高效而安全的基因转移工具,广泛应用于 基因治疗的研究。我们既往的实验证实IL.24在增生性瘢痕、瘢痕疙瘩中的表达
明显低于正常皮肤及正常瘢痕,提示IL.24的表达降低可能与病理性瘢痕的形成 有密切关系。本实验构建含有人IL.24基因的重组腺病毒载体,为下一步转染病 理性瘢痕成纤维细胞,观察IL一24在细胞中表达后对细胞增长的影响奠定实验基 础。
【方法】
TRIzol法提取皮肤成纤维细胞的总RNA后,利用RT-PCR技术扩增目的片 断IL.24;使用T4连接酶连接BglII及Xho I双酶切后的目的片断IL.24与 pAdTrack-CMV,鉴定并扩增正确重组腺病毒质粒(pAdTrack CMV-IL-24);挑选 阳性克隆的穿梭质粒pAdtrack.CMV-IL.24转入含有质粒pAdEasy-1的BJ5183感 受态细菌进行同源重组,鉴定、扩增;应用脂质体将成功重组的腺病毒载体质粒
pAdEasy-IL.24转入293A细胞中进行包装、扩增,病毒滴度测定后纯化。应用
纯化后的腺病毒载体感染病理性瘢痕的成纤维细胞。
【结果】
1.RT-PCR反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳显示扩增片断约为620bp,与目 的片断大小基本符合,无非特异性扩增。
2.腺病毒穿梭质粒pAdtrack.CMV-IL.24经B西II及Xho I双酶切后电泳见大 约9kb(质粒骨架)和620bp(IL.24基因)2个片段,与目的片断符合,测序结 果表明克隆得到的序列与GenBank中IL.24序列一致。
3.同源重组腺病毒质粒pAD.IL.24经Pac I酶切后电泳,可见约4.5kb和30kb 左右的电泳带各一条。
4.重组腺病毒质粒pAD.IL.24经质脂体转染293A细胞,2天后开始出现绿色 荧光蛋白(GFP)表达,荧光表达随时间增强。
5.用TCID50方法和GFP阳性计数法计算病毒滴度约为2.0x109pfu/ml。
【结论】
成功构建了有较强感染能力的含hlL.24基因的重组腺病毒载体。
【关键词】
病理性瘢痕;成纤维细胞;hlL.24;腺病毒;基因治疗
2
Construction and Identification of Recombinant Adenovirus Vector of hIL.24
ABSTRACT
[Objective]
Hypertrophic scar and keloid are formed with excessive proliferation of fibroblasts and accumulation of excessive collagen and other extracellular matrix.The mechanism of pathological scar is not clear and recent stud
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