人骨髓间充质干细作胞增殖、分泌、凋亡、迁移和黏附影响因素及机制-心血管内科学专业毕业论文.pdf.docx

复 旦大 学 博 士 学 位 论 文 中文 摘 要 骨 髓 干 细 胞 是 一 类 具 有 高 度 自我 更 新 和 多 向分 化 潜 能 的 细 胞 ，利 用 其 可 分 化 为 多种 细 胞 的 能 力 ，可 作 为 受 损 心 肌 组 织 修 复 的 供 体 细 胞 。骨 髓 间 充 质 干 细 胞 (m esen ch ym al ste m eells ，M sc s)是 骨 髓 中 除 造 血 干 细 胞 以外 的 另 一 类 多 能 干 细 胞 ，可 能 成 为 一 种 理 想 的修 复 损 伤 心 肌 的移 植 用 细 胞 ，其 治疗 缺 血 性 心 脏 病 、扩 张 性 心 肌 病 等 原 因 引 起 的 心 功 能 不 全 的研 究 尚处 于 起 步 阶 段 ， 正 日益 受 到 关 注 。 本 研 究 以人 M S C S 为 研 究 对 象 ，探 讨 其 增 殖 、旁 分 泌 、迁 移 、凋 亡 过 程 中不 同药 物 的 影 响 ，及 相 关 的 细 胞 信 号 传 导 途 径 。 第 一 部 分 人 骨 髓 间充 质 干 细 胞 的分 离 培 养 、鉴 定及 诱 导 分 化 【目的 〕 分 离 并 培 养 人 M S C S，纯 化 扩 增 ， 为 进 一 步 进 行 药 物 干 预 研 究 打 基 础 ， 并 检 测 细 胞 表 型 。使 用 5一氮 杂 胞 普 (5一azacytidine ，5一aza)将 人 M S C s向心 肌 细 胞 方 向 诱 导 分 化 ，进 行 细 胞 鉴 定 ， 以满 足 实 验 的 需 要 。 〔方 法 」 抽 取 志 愿 者 骨 髓 液 ，使 用 密 度 梯 度 离 心 法 分 离 骨 髓 单 个 核 细 胞 ，并 借 助 M S C S 豁 附于 塑 料 瓶 底 这 一特 性 进 行 纯 化 。相 差 显 微 镜 观 察 形 态 变 化 ，流 式 细 胞 仪 检 测 C D 34 、C D 105 、C D 106 表 面 抗 原 表 达 ，鉴 定 M S C S。将 M S C S 传 代 扩 增 培 养 ，取 第 6 代 M S C S 经 5一aza 诱 导 分 化 ，相 差 显 微 镜 观 察 形 态 变 化 ，免 疫 化 学 鉴 定 细 胞 诱 导 前 后 肌 球 蛋 白重 链 p 和 心 肌 肌 钙 蛋 白 T (cardiae troponin T，eT n T ) 表 达 。 [结 果 〕 将 密 度 梯 度 离 心 法 与 贴 壁 法 相 结 合 ， 可 获 得 较 多 的 M S C S，通 过 传 代 后 细 胞 进 一 步 纯 化 ，每 个 25 cm Z 细 胞 培 养 瓶 接 种 2 x l护 个 细 胞 ，完 全 培 养 液 胎 牛 血 清 浓 度 为 10% ，80 % ~ 90% 细 胞 融 合 后 按 1 : 3 或 1 : 2 比例 传 代 ，M S C s 能 稳 定 地 传 代 扩 增 而 无 明 显 分 化 迹 象 。 原 代 细 胞 培 养 2 周 左 右 可 首 次 传 代 ， 以后 7d 左 右 传 代 一 次 ，传 到 第 6 代 未 发 现 属 性 改 变 ， 呈 现 成 纤 维 细 胞 样 生 长 。应 用 5一axa 对 第 6 代 细 胞 进 行 诱 导 分 化 2 周 ，发 现 细 胞 形 态 变 大 ，连 接 紧 密 ，呈 条 索 状 ，外 表 似 心 肌 细 胞 ， 诱 导 前 M S C s 肌 球 蛋 白重 链 p 和 cT nT 表 达 均 阴 性 ， 诱 导 后 则 均 为 阳 性 表 达 ， 阳 性 细 胞 率 约 为 21 % 。 [结 论 ] 应 用 密 度 梯 度 离 心 法 密 度 梯 度 离 心 法 与 贴 壁 法 相 结 合 ， 可 建 立 人 M S C s 体 外 稳 定 的 纯 化 扩 增 方 法 。 体 外 5一az a 诱 导 后 2 周 ， M S C S 从 形 态 和 蛋 白表 达 水 平 上 向 心 肌 细 胞 方 向 分 化 ， 符 合 实 验 要 求 。 〔关 键 词 」骨 髓 间 充 质 干 细 胞 ; 分 化 ; 心 肌 样 细 胞 ; 5一氮 杂 胞 营  复 旦 大 学 博 士 学 位 论 文 第 二 部 分 促 红 细 胞 生 成 素 、普 伐 他 汀 、红 景 天 昔 、 抗 血 小 板 药 物 对 人 骨 髓 间充 质 干 细 胞 增 殖 、旁 分 泌 和 分 化 的干 预 研 究 【目的l 观 察 重 组 人 促 红 细 胞 生 成 素 (re co m binan t h uln an E