乳铁蛋白对人牙周膜细胞增殖迁移分化的影响-口理腔临床医学专业毕业论文.docx

硕士学位论文 亚砜，振荡15min；分光光度计测定各孔OD值并绘制生长曲线。 5．茜素红染色法检测hPDLCs的矿化能力：以5x104 mL。的密度将第3代 hPDLCs接种于六孔板，待细胞长至70％～80％时，加入矿化诱导培养基，连 续培养14 d，茜素红染色，倒置显微镜下观察并拍照。 结果 1．组织块酶消化法分离培养hPDLCs成活率较高。观察显示：游出细胞为梭形 和星形，体积较大，细胞核居中，为成纤维细胞样细胞。传代后细胞可于24h 内贴壁，贴壁后部分hPDLCs伸展为不规则星形或圆形，大部分仍为梭形， 呈放射状或漩涡状增殖。 2．SP法抗波形丝蛋白、角蛋白染色结果显示，波形丝蛋白染色后细胞质深染， 显阳性；角蛋白染色胞质浅染，为阴性。 3．流式细胞仪分析hPDLCs分子表型显示：CD29、CD44、CD90、CDl05标志 的阳性细胞率分别为98．17％、99．13％、100％和78．21％，与结果2共同表明 所培养细胞为间充质来源。 4．hPDLCs接种第3d细胞增长迅速，进入对数生长期，第5～7d处于平台期， 符合成纤维细胞生长规律。 5．矿化诱导14d的hPDLCs，茜素红染色后显微镜下可见若干大小不等的红褐 色结节形成。 第二章乳铁蛋白对人牙周膜细胞增殖、迁移的影响 采用MTT法、划痕实验、Transwell法分别检．NgL铁蛋白对hPDLCs增殖、 迁移(水平迁移和垂直迁移)的影响，探讨乳铁蛋白是否能够促进hPDLCs的 增殖和迁移。 方法 1．人牙周膜细胞的培养同第一章。 2．将第3代HPDLCs按5x104 mL．1的密度接种至96孔板，同时将培养基更换 为含有099／mL、101xg／mL、201．tg／mL LF的完全培养基，按培养及成分不同分 III 万方数据  摘要 组，每组6个复孔，分别在接种后的第1d、3d、5d、7d进行MTT检测，检 测时每孔加入MTT溶液209L，孵育4h后吸出孔内液体，每孔加入1509L 二甲基亚砜，微震荡10min，分光光度计检测490nm波长处的OD值，绘制 生长曲线。 3．取第3代生长良好的hPDLCs，以5×104 mL。1接种于6孔板，待细胞长至 80％～90％后，用2009L规格枪头沿尺子在6孔板底部划出lmm宽划痕，并 标记观测点。PBS溶液冲洗掉脱落细胞后，更换含有099／mL、1099／mL、 20I_tg／mL LF的无血清培养基，每组3个复孔，在加入刺激后选择Oh、24h、 48h对观测点拍照。 4．取第3代生长良好的hPDLCs，以5×104 mL。1密度接种至Transwell上室，用 不含血清的培养基将体积调至2009L，下室分别加入含099／mL、1099／mL、 2099／mL LF的完全培养基500rtL，每组3个复孔，孵育24h后弃去小室液体， 用棉签擦去上室未迁移细胞，4％多聚甲醛固定10min，1％结晶紫染色15min， PBS溶液冲洗，200倍视野下随机选取5处，读取细胞个数并计算均值。 5．统计学分析：所得数据用SPSS 1 9．0软件进行单因素方差分析，设定检验水 准0【=O．05；对方差齐性(Levene方差齐性检验)的资料采用Bonferroni法， 若方差不齐采用Dunnett’S T3法进行多重比较。 结果 1．MTT法结果显示三组细胞生长曲线均呈“S”形，且在第3d进入对数生长期， 第5d进入平台期，其中101xg／mL和201xg／mL LF组在各时间点增殖能力均高 于0I．tg／mL LF组，差异具有显著性俨0．05)。 2．经过24 h培养，各组细胞均向空白划痕处迁移，但099／mL LF组迁移速度较 慢，迁移48h后，1099／mL、2099／mL LF组几乎可将原有划痕覆盖，而099／mL LF组仍能观察到清晰的划痕。 3．Transwell法结果显示，24h后1099／mL、2099／mL LF组的迁移细胞数量均高 于099／mL LF组，差异具有显著性伊O．05)。 IV 万方数据  硕士学位论文 第三章乳铁蛋白对人牙周膜细胞成骨分化的影响 通过茜素红染色、PNPP法、qRT-PCR以及Western Blotting analysis观察乳 铁蛋白对hPDLCs矿化结节形成以及对成骨诱导相关基因和蛋白表达的影响， 探讨乳铁蛋白是否具有促进hPDLCs成骨分化的作用。 方法 1．人牙周膜细胞的培养同第一章。 2．将第3代hPDLCs按5x104mL。1的密度接种于6孔板，待细胞单层贴壁后更 换完全培养基为含有0 gg／mL、10}tg／mL、20 gg／mL乳铁蛋白的成骨诱导液， 每组3个复孔，每3d换液1次，矿化14d后弃去培养液，4％多聚甲醛固定 10 min，