白细胞抗原系统检测.pptVIP

CWD原则 HLA等位基因定义为三大类 常见等位基因（Common alleles） 指那些在参考群体中频率大于0.001的等位基因 确认等位基因（Well-documented alleles） 至少在五个独立非亲缘个体中或者三个独立非亲缘个体中并伴有特定的单体型被检测到的等位基因 罕见等位基因（Rare alleles) 除常见等位基因和确认等位基因以外的所有等位基因 它们的频率很低 CWD原则 CWD原则 CWD原则分型中将常见等位基因和确认等位基因合并为CWD,当模棱两可的等位基因组合中出现CWD等位基因可能需要进一步区分，而出现罕见等位基因组合，其临床分型中实际意义有限，可予以排除 单链DNA抽提技术 单链DNA抽提技术将个体两个等位基因进行分离 根据等位基因序列设计生物素标记的特异性探针（仅与某一等位基因互补） 探针与标本基因组DNA进行杂交反应 杂交后将形成单一等位基因DNA/特异性探针复合物 加入链亲和素标记磁珠，将形成单一等位基因DNA/特异性探针/磁珠复合物 洗涤后溶液中只含有单一等位基因DNA/特异性探针/磁珠复合物 单链DNA抽提技术 单链分离技术 探针结合杂交互补 选择性获取单体型 商业产品 HLA-C*01:02 Biotin-CTC CAT gAA gTA TTT CTT CA 图为单链抽提C*01:02后测序的一段序列 单链扩增技术 该技术原理类似于PCR-SSP 选择合适的引物只扩增个体两个等位基因的特定等位基因 比对序列 设计特异性引物 重点在于引物序列 TGGCGCCCCGAACCCTCG 图为单链扩增A*24:02后测序的一段序列 组特异性测序引物技术 该技术原理利用特异性引物进行测序反应 在测序过程中设计特异性的测序引物 该引物只能与某一个等位基因的序列互补 该引物测序将得到与引物序列互补的某个特定等位基因的序列 A-98T CACTCCATGAGGTATTTCTT A-98A CACTCCATGAGGTATTTCTA 图为A*02:01,11:01用特异性引物测序后的比较 第四节 粒细胞抗原抗体检测 重点提示 掌握粒细胞抗原、抗体检测血清学诊断方法的原理 粒细胞凝集试验 粒细胞免疫荧光试验 流式细胞技术 单克隆抗体粒细胞抗原捕获试验 ELISA方法 掌握HNA系统基因分型技术原理及其适应范围 PCR限制性片段长度多态性 PCR序列特异性引物 PCR直接测序法 多重SNaPshot 技术 第四章 白细胞抗原检测 严力行 目 录 第一节 HLA血清学检测 HLA抗原检测 HLA抗体检测 第二节 HLA细胞学检测 第三节 HLA分子生物学检测 HLA的分子生物学检测方法 HLA常见基因分型方法比较 HLA分型模棱两可结果的原因及其对策 第四节 粒细胞抗原抗体检测 第一节 HLA血清学检测 重点提示 HLA抗原检测 掌握微量淋巴细胞毒实验的原理及其影响因素 HLA抗体检测方法 淋巴细胞毒方法 流式细胞仪方法 ELISA方法 Luminex检测技术 掌握不同方法的原理及其优缺点 微量淋巴细胞毒试验 HLA抗原的血清学分型方法 用一系列已知的抗HLA标准分型血清来检测未知淋巴细胞表面的HLA抗原型别 微量淋巴细胞毒实验原理 基于抗原抗体反应 抗原抗体免疫复合物在补体的作用破坏细胞膜 利用染料或其它方法鉴定和区分死活细胞 计分法：NIH计分法 HLA抗血清的来源 HLA抗体血清来源 同种免疫刺激产生HLA同种抗体 HLA抗原免疫刺激动物 杂交瘤技术 人群存在的天然抗体 微量淋巴细胞毒试验的影响因素 HLA抗血清 抗血清来源和抗体种类、抗血清效价、抗血清特性、抗血清质量 淋巴细胞 淋巴细胞活性 、淋巴细胞纯度、淋巴细胞数量、淋巴细胞上抗原表达异常 孵育时间和温度 补体活性 染色和固定时间 血清学抗原分型方法评价 血清学方法抗原分型 检测HLA-Ⅰ类和Ⅱ类抗原 检测HLA-Ⅰ类抗原相对容易 检测HLA-Ⅱ类抗原需要分离和纯化Ｂ淋巴细胞 易受多种因素影响 其错误率相对较高 HLA血清学某一座位上只能检测到一个抗原，而基因分型存在两个不同等位基因，应考虑到无效等位基因 HLA抗体检测 补体依赖的淋巴细胞毒方法（CDC） 采用淋巴细胞作为靶细胞抗原 易受多种因素影响，检测敏感性最低 ELISA 方法 ELISA方法能检测HLA-I和HLA-II抗体 流式细胞术 采用淋巴细胞作为靶细胞抗原 结合荧光检测技术特点 Luminex检测技术 结合荧光流式细胞仪和免疫标记技术 可区分HLA-I和HLA-II抗体 可鉴定抗体的属性和强度 HLA抗体检测 Luminex检测技术 以包被抗原的微球磁珠作为靶细胞 每种磁珠上包被一种抗原 多种磁珠可以在同一体系内反应 待测血清与