三七萜类学骨架生物合成途径关键酶ispg和ggpps基因的克隆和表达分析-中药学专业毕业论文.docx

原创性声明本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立进 原创性声明 本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立进 行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、 数据、观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内容外，不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究 成果做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名-：．蛩盆避 日 期：J丝L』∑址 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解广西中医药大学有关保留使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权广西中医药大学可以将学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。 (必威体育官网网址论文在解密后遵守此规定) 论文作者签名：：至l必 导师签名 刎0 日 期：亟l妄：呈：蓼 日 期 级 。j I盛 万方数据 三七萜类骨架生物合成途径关键酶 三七萜类骨架生物合成途径关键酶 ispG和GGPPS基因的克隆和表达分析 中文摘要 目的：根据前期三七转录组测序结果筛选出位于三七萜类骨架生 物合成途径中的关键酶香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)及4．羟基．3-甲 基．2一烯基二磷酸合酶(ispG)，克隆得到GGPPS和卸G基因的全长序 列信息，初步分析其结构特征、时空表达规律，探讨其对萜类物质代谢 的影响。构建GGPPS原核表达载体，为深入酶的功能研究及品质形成的 分子遗传调控提供基础。 方法：在Unigene序列信息基础上，结合eDNA末端快速 扩增(RACE)技术克隆出三七妇PG及GGPPS基因全长；运用实时荧光 定量PCR，采用双标准曲线SYBR法分析三七GGPPS和卸G基因在不 同发育时期、不同器官中的时空表达规律；使用pET-30a(+)构建GGPPS 原核表达载体pET-30a(+)．GGPPS，转入BL(DE3)宿主菌中诱导表达， 获得融合蛋白，并对其进行纯化复性。 结果：实验克隆得到卸G基因eDNA全长序列2 284 bp，最长 开放阅读框为2 223 bp，该基因编码740个氨基酸，与绒毛烟草、橡胶树、 芝麻的ispG一致性达到89％以上，具有GepE超家族结构域；实时荧光 定量PCR结果显示，卸G基因在1、2、3年生三七的根、茎、叶和3年 生的花等不同器官组织中均有表达，但以叶中具有显著水平的高表达量， 其他组织部位表达量均较低。G删基因eDNA序列全长1 203 bp的， 最长开放阅读框为1 035 bp，GeneBank登录号为：KM486564，相应基因 全长2 370 bp，包含1个内含子和2个外显子，该基因编码344个氨基酸， 与蓖麻、丹参等植物GGPPS的一致性达到73％以上，具有富天冬氨酸区 等多个保守结构域，属于类异戊二烯合成酶超家族；实时荧光定量PCR 万方数据 结果显示，GGPPS在1、2、3年生三七的根、茎、叶和3年生的花等不 结果显示，GGPPS在1、2、3年生三七的根、茎、叶和3年生的花等不 同器官组织中均有表达，但以3年生叶中具有显著水平的高表达量。构 建的得到的pET-30a(+)．GGPPS原核表达体系能够成功表达出 pET-30a(+)．GGPPS融合蛋白，实验考察确定该蛋白的最佳诱导条件为： O．1 mmol—L 1 IPTG，诱导6h，该蛋白主要以包涵体形式存在于细胞内， 通过Ni．NTA的纯化，能够得到纯度较高的融合蛋白。 结论：克隆得到三七卸G和GGPPS基因，结合gspG和GGPPS两 个基因时空表达规律的研究，以及生物信息学分析，认为这两个基因均 参与萜类骨架生物合成途径，影响三萜的积累和三七品质的形成；与三 七叶片叶绿体的发育、叶绿素和类胡萝卜素的合成，以及三七的阴生适 应性相关。通过对GGPPS原核表达获得pET-30a(+)．GGPPS的融合蛋白， 为后续酶的活性功能验证奠定基础。总之，本文克隆了两个三七萜类生 物合成骨架关键酶基因，初步分析了其时空表达和生物学功能，为研究 三七品质的形成、三七阴生的生态生理习性与其品质形成的关联性，以 及基于分子遗传调控的三七品质改良等提供了基础。 关键词：三七，GGPPS，ispG，实时荧光定量PCR，原核表达，萜 类骨架 万方数据 Cloning Cloning and characterization of ispG and GGPPS gens related with terpenoid backbone biosynthesis in panax notoginseng ABSTRACT Objective：Accordi