三叶青扩展蛋白基因的克隆和块根内生真菌的分离鉴定及其分析-植就物学专业毕业论文.docx

致谢时光荏苒，转眼间三年的研究生生活即将结束，至此离别之际，我要向给予 致谢 时光荏苒，转眼间三年的研究生生活即将结束，至此离别之际，我要向给予 我关心和帮助的老师、同学和朋友亲人表示衷心感谢。 首先，我要由衷地感谢我的导师向太和教授!感谢向老师在学习和生活中对 我的教导和指引。向老师广博的学识、严谨求实的态度，一丝不苟的作风，踏踏 实实的精神，是我今后工作、学习中的榜样，给予我无尽的启迪。从论文的选题 到材料收集以及实验思路的探讨，都离不开向老师的悉心指导与不懈支持。在此 谨向向老师表示无尽的感谢与祝愿。 其次，我要感谢王利琳教授、庞基良教授、陈哲皓老师以及余建军老师在课 程学习与生活上的指导和帮助，感谢王慧中教授开放分子生物学实验室为我实验 的顺利进行提供了帮助。 再次，感谢同门王沙沙、王嫂、武盼和李亚菲在实验和生活上对我的关心和 帮助，感谢室友刘圆、陈薇、何露霞三年中带给我的欢乐与感动，感谢二楼实验 室的兄弟姐妹们热忱的帮助，是你们陪伴我度过了这段美好难忘的时光，真诚的 谢谢你们! 最后，我要感谢我的父母和姐姐弟弟，感谢你们给予我满满的爱意和无微不 至的关怀；感谢你们一直以来对我的鼓励与肯定；感谢你们总是想把最好的给我。 你们的陪伴将是我今后不断前行的动力。 万方数据 摘要三叶青(Tetrastigma 摘要 三叶青(Tetrastigma hemsleyanum DielsGilg Diels)为我国珍稀药用植 物，全株均可入药，以球形块根药用价值最高；但自然条件下三叶青生长缓慢， 目前已无法满足市场的需求。扩展蛋白是一类普遍存在于植物细胞壁的蛋白质， 不仅可以使细胞伸长生长，而且可以通过调节细胞壁柔韧性使其适应周围环境； 植物内生真菌在自然界广泛存在，且种类繁多，在长期的进化过程中，内生真菌 与宿主植物形成互惠互利的关系，内生真菌既可以影响植物的生长发育，又可以 提高植物的抗旱、抗盐、抗病等抗逆性，并且对宿主植物代谢产物的产生具有影 响作用。 本研究首先克隆了三叶青扩展蛋白基因(Th．exp)全长cDNA序列；其次， 分离鉴定了三叶青块根中的内生真菌并进行了细胞学观察；最后，测定了接种内 生真菌发酵液的三叶青无菌苗中扩展蛋白基因表达量以及药用活性成分总黄酮 的含量。具体研究结果如下： (1)根据GenBank中登录的扩展蛋白基因保守区域序列设计1对简并引物， 以三叶青球形块根cDNA为模板进行PCR扩增，再结合RACE技术，获得三叶青 扩展蛋白基因全长cDNA序列(命名为Th—exp)，共782 bp，其中包含630 bp开放 阅读框，编码209个氨基酸(序列已被GenBank收录，登录号KP693606)。Th—exp 编码的蛋白质具有典型的扩展蛋白结构特征，N端含有8个半胱氨酸的结构域，C 端含有4个保守的色氨酸结构域，中间含有组氨酸功能域。Blast分析显示，Th．exp 与葡萄、醉蝶花中扩展蛋白基因具有相似性。半定量RT．PCR和荧光定量PCR分 析表明，Th—exp基因在三叶青叶、茎、普通细根和球形块根中均有表达，但球形 块根中表达强于其它器官。 (2)采用组织块分离法，从三叶青多年生块根中共分离到31株内生真菌， 菌株颜色、质地、生长速度等具有差异性。通过对内生真菌的ITS rDNA序列进 行扩增和分析，将分离到的内生真菌归于10个属，分别是镰刀菌属、根盘菌属、 炭疽菌属、柱孢属、翅孢壳属、青霉属、小不整球壳属、曲霉属、链格孢属、帚 枝霉属等；另有编号8．16．10．2菌株为未培养真菌(uncultured fungus)，其中镰 刀菌属为三叶青块根中的优势菌属。此外，制作三叶青多年生块根石蜡切片，采 用番红．固绿法染色并观察，结果显示，三叶青内生真菌多散乱分布于细胞皮层 万方数据 及韧皮部部位，定殖于宿主植物块根的单个或多个连续的细胞中。 及韧皮部部位，定殖于宿主植物块根的单个或多个连续的细胞中。 (3)选取三叶青块根中出现频率较高菌属真菌的发酵液添加到MS培养基中 培养三叶青无菌苗，荧光定量PCR检测显示，Th．9．7．1、Th．9。7．2、Th．1】．23—1植 株叶片中Th—exp基因均上调表达，其中，Th．9．7．2中表达量约是对照组的3倍多， 差异性最大；而Th．8．16．8、n．8．16．13．1中Th—exp基因的表达量降低；植株Th．9．7．5 中该基因表达量无明显变化。使用紫外分光光度计测定叶片中药用成分总黄酮的 含量，结果显示，9．7．1、9．7．5、8．16．8、11．23．1菌株均可诱导三叶青黄酮含量的 升高，其中Th．9．7．5植株含量高达39．6194 mg／g．DW，而Th．9．7．2、Th．8．16．13．1中 黄酮含量与对照组无明显差异。 关键词：三叶青；扩展蛋