人类精原干细胞体外培养初步研究-生殖来工程专业毕业论文.pdf.docx

博十学位论文 博十学位论文 中文摘要 摘 要 精原干细ffl蔓(Spermatogonial stem cells)是男性生殖细胞系中特有 的一种干细胞。它不仅能自我复制形成新的精原干细胞，而且还能通 过减数分裂的方式分化为终末端细胞精子。因此，精原干细胞对于维 持睾丸内干细胞池的稳定和生精过程的持续具有重要的作用。然而， 人类精原干细胞的体外培养建系研究却鲜有进展。 目的：本研究是主要目的是探索一种适合人精原干细胞生存和扩 增的体外培养体系，为研究生殖干细胞的发育过程建立良好的实验平 厶 口。 方法：本实验主要采用不同种类的饲养层细胞和性激素以及细胞 因子联合作用构建体外培养体系。从人类胚胎和成熟睾丸组织中分离 精原干细胞，接种在不同密度的人成纤维细胞饲养层和小鼠成纤维细 胞饲养层上进行培养，筛选出最合适的支持细胞体系。在此基础上， 分别添加不同浓度的性激素例如睾酮(Testosterone)和雌激素 (Estrogen)及多种的细胞因子例如干细胞因子(SCF)，胶质细胞营 养因子(GDNF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)矛11白血病抑制因子 (LIF)及碱性成纤维细胞生长因子加白血病抑制因子(bFGF+LIF)组合 以检测其是否对精原干细胞具有促进增殖的作用。在培养过程中，应 用5．溴，2’一脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)整合实验和原位凋亡检测实验 (TUNEL)筛选出最佳的培养体系。同时，在培养基中加入P13K和ⅧK 信号通路的抑制剂(LY294002，U0126)对有效的影响因子进行阻滞以 博士学位论文 博士学位论文 中文摘要 检测其作用机理。培养得到的细胞克隆应用免疫细胞化学并HPCR技术 对生殖细胞基因和多能性基因进行检测。 结果：本实验结果表明，密度为1X105／1．39cm2的人成纤维细胞作 为饲养层能最大限度的维持细胞不发生凋亡，但对细胞并无促进增殖 的能力。我们发现添3nSCF能促进人幼稚型精原干细胞克隆的产生， 尤其能重新激活已经进入有丝分裂停滞期的幼稚型精原干细胞重新 恢复分裂，但其作用时间不超过两周。同时SCF的作用效果具有明显 的剂量依赖性和年龄特异性。使用特异性的信号阻断剂LY294002和 U0126阻断P13K和ⅧK通路后能中幂13SCF的作用并导致幼稚型精原 干细胞发生凋亡。幼稚型精原细胞克隆表达特异性生殖细胞抗原 DAZL，VASA，MAGE．A4矛l：lPlzf以及多能性标记如AIo，Oct。4和 SSEA．4等。PCR结果显示幼稚型精原干细胞表达一系列胚胎干细胞的 特定基因如Oct．4,Nanog，THY-1，Sox一2和LEFTA等。与幼稚型精原干细 胞不同的是，成熟型精原干细胞的增殖tESCF依赖但依靠bFGF和LIF 两个因子的联合作用，其作用时间也不超过三周。特异性阻断P13K 和ⅧK信号通路后并不能导致成熟型精原干细胞发生凋亡。成熟型 精原干细胞克隆也表达DAZL，VASA，MAGE．A4和Plz辟特异性生 殖细胞表标记。与幼稚型精原干细胞一样，成熟型精原干细胞也表达 Oct．4和AIo等多能性标记，但不表达SSEA．A4。PCR结果显示成熟型 精原干细胞也表达胚胎干细胞特定的多能性基因。 结论：本实验发现SCFO皂诱导幼稚型精原干细胞克隆形成，而成 熟型精原干细胞则依赖bFGF和LIF的刺激才能形成克隆。目前的培养 博十学位论文 博十学位论文 中文摘要 体系不能维持人精原干细胞的体外长期扩增，提示可能还有其他关键 细胞因子有待研究。并且，培养得到的克隆表达一系列多能性标记。 关键词：精原干细胞，细胞因子，体外培养，多能性，发育生物学 Ill 博士学位论文 博士学位论文 英文摘要 ABSTRACT Spermatogonial stem cells are the unique germline stem cells residing in the testis，which can self-renew to produce new stem cells as well as differentiate into the terminal sperm through meiosis．Thus， spermatogonial stem cells are crucial for the maintenance of stem cell pool and continuous spermatogenesis in the testi