单克隆抗体制备和应用.pptVIP

单克隆抗体的制备和应用 B淋巴细胞杂交瘤技术是如何创立的 多克隆抗体（Polyclonal antibody, pAb） 用包含多种抗原决定基的抗原物质免疫动物，从而刺激多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体的总和，称为多克隆抗体 单克隆抗体（Monoclonal Antibody, mAb）由一个杂交瘤细胞克隆所产生的，针对单一抗原 决定簇的抗体，称为单克隆抗体 单克隆抗体的优点 单特异性和均一性 杂交细胞（hybrid cell） 在外界某些条件干预下（如PEG、电穿孔），当两个细胞紧密地接触的时候,其细胞膜可能发生融合，产生具有原来两个细胞染色体/基因的单个细胞，称为杂交细胞 杂交瘤细胞（Hybridomas） 若用一种肿瘤细胞与另一种体细胞（如淋巴细胞）融合，所形成的杂交细胞称为杂交瘤细胞，简称杂交瘤。其既具有肿瘤细胞无限增殖的能力，也具有淋巴细胞的一些特性 B淋巴细胞杂交瘤 骨髓瘤细胞与免疫B细胞融合所产生的杂 交瘤细胞 抗原制备 免疫动物 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 细胞融合 杂交瘤细胞的选择培养 杂交瘤细胞的筛选及克隆化 单克隆抗体的鉴定 单克隆抗体的制备 一、抗 原 B淋巴细胞在目的抗原刺激下增殖、分化，形成能分泌特异性抗体的B淋巴细胞，有利于细胞融合形成分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。多次免疫可通过抗体亲和力成熟机制，使B细胞分泌高亲和力抗体，由此形成的杂交瘤往往可分泌高亲和力抗体，有更高的应用价值。  所选择的骨髓瘤细胞应与提供免疫脾细胞的动物  品系相同 拉颈处死小鼠 无菌操作取出脾脏 清洗、研磨 收集细胞 离心洗涤 细胞计数 细胞融合 在聚乙二醇作用下B淋巴细胞可与 骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞 五、杂交瘤细胞的选择性培养 HAT选择性培养的原理： 细胞的DNA生物合成有主要途径和补偿途径。当有氨基碟呤存在时，能够阻断DNA合成的主要途径，需通过补偿途径合成DNA，这时就需要次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）利用次黄嘌呤合成DNA，或胸腺嘧啶核苷激酶（TK）利用胸腺嘧啶核苷合成DNA。 用于杂交瘤融合的骨髓细胞缺乏HGPRT和TK，在HAT培养液中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏HGPRT和TK ，不能利用补救途径合成DNA而死亡。 未融合的B淋巴细胞虽具有HGPRT和TK ，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有骨髓瘤细胞与免疫B细胞融合的杂交瘤既有骨髓瘤细胞无限增殖的能力，又从免疫B细胞得到HGPRT和TK 的基因产物，因此，能够克服氨基碟呤的阻断作用，通过次黄嘌呤的补偿途径合成DNA，而在HAT选择培养液中生长繁殖。 融合后3~4天后，可见外形似骨髓瘤细胞，浑圆透亮的克隆。 融合后第7~9天取培养上清，检测特异性抗体。 六、杂交瘤细胞的筛选及克隆化 杂交瘤分泌单克隆抗体的检测方法 杂交瘤细胞的克隆化 在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。 克隆化—即把培养孔中的细胞从单个细胞进行培养繁殖，使之成为单克隆，其分泌的抗体达到均一性。 有限稀释法 软琼脂培养法 以适当浓度杂交瘤细胞加入软琼脂培养 基中，形成由一个细胞增殖而成的细胞集落。 杂交瘤细胞的克隆化筛选： 免疫球蛋白类别及亚类的鉴定 抗体亲和力是指抗体与抗原或半抗原结合的强度，其高低主要是由抗体分子结合表位部位和抗原决定簇之间的互补程度决定。 八、单克隆抗体的制备 动物体内诱生法 取Balb/c小鼠, 首先腹 腔注射0.5ml液体石腊或 降植烷进行预处理。 1~2周后, 腹腔内接种杂交 瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠 腹腔内增殖，并产生和分泌 单克隆抗体 约1~2周, 可见小鼠 腹部膨大。用注射器 抽取腹水，即可获得 大量单克隆抗体。 将杂交瘤细胞置于培养瓶（或灌）中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体。收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体，不含无关Ig，但成本髙。 我国单克隆抗体的发展历史和前景 早期研究阶段 全军单克隆抗体研究协作组（单克隆抗体通迅） 应用和市场化 HLDA HCDM 功能基因组研究中的重要地位 国家重大科技项目（973、863等）主要研究 内容之一 单克隆抗体的应用 基础理论研究（生命科学） 发病机理的研究 疾病的预防（