二代测序技术在医学领域中应用.pptxVIP

二代测序技术在医学领域中的应用; 概要;二代测序技术简介;人类基因组Human Genome;DNA的构成;末端终止法测序;ABI 3700 (ABI 3730);人类基因组计划(HGP);Celera Genomics;Ventor基因组测序;降低消耗的办法;降低消耗的办法;桥式PCR;二代测序（NGS）;边合成边测序（SBS）;SBS技术特点;Hiseq 2500;常见医学领域NGS方案;二代测序应用医疗的可行性;NGS的优势;常见医学领域NGS方案;常见医学领域NGS方案;全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。 ;SNP（个体间差异） CNV（大片段基因拷贝数变异） InDel SV（结构变异） ;SNP(SNV);示例;为何研究SNP？;大多数的SNP都是无用的;但也有例外;诊断实例： Dr. James Gern和Joseph DeRisi合作，用MiSeqDx从一个病危的十几岁的男孩的脑脊液中抽提出核酸样本，测了8百万条核酸序列，从中检出了475条钩端螺旋体的序列，从而判定这个男孩的病是因为钩端螺旋体感染。 Dr. James Gern依据上述的判断，给男孩青霉素治疗，治好了这个男孩的病。脑脊液是较难取得的体液，只能是采集很少的量，这就限制了所能得到的核酸总量。 钩端螺旋体，在病原体的常见程度排名中是较靠后的种类。在本案例中，如果用PCR方法，挨个排查病原体，可能还没排到钩端螺旋体，核酸就不够了。但高通量测序克服了核酸量不够的问题。 在本案例中，钩端螺旋体DNA只占总DNA的万分之0.6，含量极微，但经过高通量测序，得到了475条钩端螺旋体的DNA，这让钩端螺旋体无处循形。;2009年H1N1病毒爆发感染时，有一名病人死于呼吸系统引起的多器官衰竭，然而并不知道具体的死因。科学家把病人的肺部穿刺组织的DNA拿来做高通量测序。最终在950万条序列中，含有0.85%的序列来自于H1N1病毒基因组，从而帮助科学家发现了该病人的真正死因。在这样高人类基因组干扰的背景下，目前其他技术都难以快速发现致病病毒序列、以及分子分型。;Nimblegen (Roche) SureSelect(Agilent) RNA Oligo Trusight (Illumina);癌症相关（人） 遗传性疾病（人） 其它非传染性疾病（人） 主要用于寻找罕见突变，遗传性突变及癌症相关的体细胞突变 可以做SNP，InDel分析，但由于捕获区域较短，一般不用于CNV，SV分析。 ;成本低（一般50-150X，也仅需要8-15G数据） 降低分析背景，容易发现稀有突变。 大约能测到50-80bp的片段缺失，由于外显子捕获芯片片段较短，很难判断是由捕获脱靶导致还是由缺失导致。 同样因为捕获芯片片段较短，一般不做CNV，SV分析。;WES方案流程;包括mRNA-Seq，lncRNA-Seq，sRNA-Seq等。 可以高通量分析转录本信息，发现未知的转录本和基因注释。 寻找个体间，同一个体不同时期等感兴趣基因表达丰度变化。;mRNA-Seq方案;有关lncRNA的一些知识：;lncRNA-Seq;sRNA-Seq;RNA-seq的优势;RNA-seq的挑战;石蜡包埋样本解决方案;FFPE样本(石蜡包埋切片组织);样本量巨大，80%以上的临床样本都使用石蜡包埋保存 很多珍贵的临床样本已经做过组织学，病理学研究，很容易完成相关实验验证 ;难于抽提，福尔马林处理后的DNA容易产生交联，使提取出的DNA量偏低 提取出的DNA质??低，通常降解200bp-5kb 降解程度与石蜡包埋的时间相关 ;;是否有相同突变?;目前无法用于WGRS，样本降解严重，对DNA覆盖度有很大影响。 DNA量过少，质量很差。 石蜡包埋时间越长，福尔马林对DNA交联和损伤就越大。 未使用保护缓冲液处理的福尔马林影响更大。;CTCS和ctDNA;什么是CTCs？;CTCs研究意义;CTCs研究难点;CTCs的富集;通过细胞形态富集;微流芯片;密度梯度离心;免疫磁珠富集法;微流体;CTCs鉴定;CTCs与NGS的结合;ctDNA;ctDNA与NGS的结合;CTCs与ctDNA分析比较;