分子生物学常用技术及其应用.pptVIP

尽管PCR扩增DNA非常有效，但目的DNA序列的指数扩增并不是一个无限制的过程。 在正常的反应条件下，经30次循环之后，酶的催化反应趋于饱和，就会出现平台效应 (Plateau) ，产物的量不再增加。 “平台效应”出现的迟早还取决于酶的性能、模板DNA的拷贝数、dNTP浓度等多种因素。 RT—PCR 以mRNA为原始模板的PCR，亦称逆转录PCR。 逆转录反应在42 ℃进行，随后将反应混合物加热至95 ℃5min，灭活逆转录酶，取2ul反应产物，按DNA为模板的PCR反应步骤，进行扩增反应。 三、PCR在医学中的应用 对人类遗传信息的认识和研究 基因工程药物与疫苗生产 转基因动物和植物制造 基因诊断与基因治疗 镰刀型红细胞贫血 Chehab等设计一对引物把含有突变的DNA片段（共294bp）扩增，扩增产物用限制性内切酶 OxaN I消化，琼脂糖凝胶电泳后染色观察： 正常人有2个片段，191 和 103bp， 镰刀状红细胞贫血的 纯合子，仅有一个片段294bp 杂合子有191、103和294bp 3个片段 综合了分子生物学、微电子学、微加工和计算机等学科知识 本质：在固定的玻片等载体上的微型生物化学分析系统，芯片上每平方厘米可排列成千上万生物分子，能快速准确地检测核酸，并获取样品中的有关信息。 第四节 DNA芯片技术 分子生物学常用技术及其应用 第一节 基因工程 一基因工程的基本概念 DNA重组——不同来源的DNA分子通过末端共价连接而形成重新组合的DNA分子的过程。 基因工程——采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程。 生物技术——包括基因工程、蛋白质工程、酶工程、、细胞工程。 克隆——通过无性繁殖所产生的与亲代完全相同的子代群体。 二、工具酶 限制性核酸内切酶：能从中间有选择性地切割DNA分子特异序列。 DNA连接酶 DNA聚合酶 逆转录酶多核苷酸激酶 碱性磷酸酶 末端脱氧核苷酸转移酶 三、载体 载体必须符合以下几点要求： （1）能在宿主细胞内复制并具有较高的拷贝数 （2）容易进入宿主细胞 （3）具有多个限制性核酸内切酶单一的酶切位点 （4）容易从宿主细胞中分离纯化 （5）有容易被识别筛选的标志 常用的载体包括：质粒、λ噬菌体、粘粒、病毒 由质粒与λ噬菌体构成 四、重组DNA技术的基本原理 制备DNA片段，并通过载体将其导入受体细胞，在受体细胞中复制、扩增，以获得单一DNA分子的大量拷贝。 五、重组DNA技术的基本过程 （一）制备目的基因和载体； （二）DNA的重组； （三）重组DNA导入宿主细胞 （四）DNA重组体的筛选和鉴定 （五）DNA重组体的 扩增和表达 （一）目的基因的 制备： 目的基因的筛选和分离可采用以下方法进行： 1．直接从染色体DNA中分离： 仅适用于原核生物基因的分离，较少采用。 2．人工合成： 根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。 3．从mRNA合成cDNA： 采用一定的方法钓取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶催化合成其互补DNA（cDNA），除去RNA链后，再用DNA聚合酶合成其互补DNA链，从而得到双链DNA。这一方法通常可得到可表达的完整基因。 4．从基因文库中筛选： 将某一种基因DNA用适当的限制酶切断后，与载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组DNA的种群，称为G文库(genomic DNA library)。 将某种细胞的全部mRNA通过逆转合成cDNA，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNA library)。C-文库具有组织细胞特异性。 5．利用PCR合成： (聚合酶链反应） 如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术，在体外合成目的基因。 （二）目的基因与载体连接(DNA的重组）  主要通过DNA连接酶和双链DNA粘性末端序列互补结合。 1、粘性末端连接 利用同种限制性内切酶切开载体和DNA分子，能产生相同的粘性末端，在T4连接酶作用下遍可互补。 2、同聚物加尾连接 在酶的催化下人为在DNA链3‘末端添加多聚脱氧单核苷酸，制造粘性末端。 3、平末端连接 在 T4 DNA连接酶的作用下，直接连接DNA平端末端，效率较低。 4、人工接头连接 在平端DNA末尾加上人工合成的具有限制性DN