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第六章 植物离体培养育种  Tissue culture and breeding §1 植物离体培养发展简史、意义和生物学原理 组织培养的概念 组织培养（Tissue culture）是指用无菌方法使植物体的离体器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称，也称之为离体培养（In vitro culture）。 按培养材料分为（Gamborg等)： 类别 －依外植体的不同划分 胚胎培养 （embryo culture）未成熟或成熟了的胚 器官培养（organ culture）根尖、茎尖、子叶、叶片、叶原基、花原基、或花果的未熟部分 组织培养或愈伤组织培养（狭义，tissue culture）维管束形成层、贮藏薄壁组织及愈伤组织等 细胞培养 单个游离细胞 （分离出的体细胞/花粉细胞/卵细胞） 原生质体培养 除去细胞壁的原生质体 发展简史 1958年，英国科学家Steward 等用胡萝卜根的愈伤组织细胞进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整的小植株，不但使细胞全能性理论得到证实，而且为组织培养的技术程序奠定了基础。 1962年，Murashinge 和Skoog 在烟草培养中筛选出至今仍被广泛使用的MS培养基。 1964-1966年，印度科学家Guha 和Maheswari 在曼陀罗花药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体植株。 1972年，Carlson 通过两个种的烟草原生质体融合培养，获得了第一个体细胞杂交的杂种植株。 植物组织培养在技术上的发展 研究材料范围逐步扩大 培养方法逐步完善 培养基不断改进 实验手段逐步完备 组织培养的意义 胚胎培养 主要克服远缘杂交中胚不能在种子中正常发育而早期败育的问题。 胚珠和子房培养 进行试管内受精和杂种胚的分化成长，以克服不育性和不亲和性等障碍。 细胞及组织培养 进行优良单系的快速繁殖，自交不亲和系、雄性不育系的无性繁殖，突变体的诱导与分离及种质的保存和运输等方面。 花药及花粉培养 单倍体育种，加速获得纯二倍体。 原生质体培养 进行体细胞杂交、核移植和核置换等工作。 愈伤组织培养是最为常见的组织培养方式？ 愈伤组织（Callus）： 原指植物在受伤后，于伤口表面形成的一团薄壁细胞。 外植体（Explants） 由活植物体上切取下来的可以用于组织培养的组织或器官 生物学原理 植物的再生作用：植物的根、茎、叶等器官、组织和细胞都具有再生成完整植株的能力。其是无性繁殖的基础，它是受内源激素调控的。人工控制和调整培养基成分，可使其发育成完整的植株。 细胞的分化和形态发生：指细胞在分裂过程中发生结构和功能方面的改变，从而在植物个体发育过程中形成各类组织和器官，完成整个生活周期。 植物对无机盐类的需求具有广泛的一致性，偶然加以变动。一般多采用蔗糖。维生素中最关键的是B1，一般用量为0.1-0.4毫克/升。氨基酸和酰胺只用于某些组织培养，而在器官增殖阶段加入腺嘌呤也可能是需要的。关键的有机成分主要是激素和细胞分裂素。 可以采用固体或者液体培养基，根据不同植物和不同培养阶段而定。固体培养基中以琼脂质量好，配制时可以通过调节pH值来达到适合的凝胶状态即可。液体培养基养时也有固定和搅动两种。 以KNO3为例 在配制培养基时，取10ml，10ml×0.19g/ml=19g §3 通过花药及花粉培养的单倍体育种 单倍体植物在育种上的意义 概念：凡是具有配子体的染色体数的植物称为单倍体植物。单倍体≠一倍体，是一个“半倍体”。单倍体在自然界普遍存在，1922年发现了曼陀罗的单倍体植株，但自然发生率很低（0.002~0.02%）。 人工诱导单倍体在育种上的用途 从单倍体的染色体加倍即可获得纯合的二倍体，也可获得纯合的多倍体，育种途径快速。 有利于远缘杂种新类型的培育和稳定。 单倍体植物与诱变育种相结合，可以加速诱变育种的进程。 花药及花粉培养工作的进展 起始于20世纪40年代，最初研究目的是调节和控制从花粉母细胞到成熟花粉的生长发育。大约经过半个世纪的发展，通过花药和花粉培养诱导形成单倍体植物，目前在世界范围内已得到普及，已从170多种植物成功地诱导形成花粉起源植株或愈伤组织，以茄科、十字花科蔬菜作物研究居多。在曼陀罗、番茄、麝香百合、银杏、烟草、矮牵牛等植物上都较早诱导成功单倍体植物。 花药和花粉培养技术 1. 花药培养技术流程图 花药和花粉培养技术 花粉培养 的花粉分离和培养方法 机械分离培养法（包括液体培养基培养法和固体培养基培养法）； 散落花粉（shed pollen）培养法。 花药培养和花粉培养之比较 统计表明，通过花药培养获得单倍体的植物种类或品