一、质粒载体.ppt

DNA重组技术前言 第一节 常用的工具酶 工具酶： DNA重组技术，需要利用一些酶在体外对 DNA进行切割、连接等基因操作，这些酶常被称 为工具酶。 主要工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 逆转录酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 一、限制性内切酶 1.简称限制酶，是DNA重组技术的基本工具 2.能识别和切割双链DNA分子特异序列的核酸水解酶 3.在细菌体内与相伴存在的修饰酶（甲基化酶）共同构成细菌的限制－修饰体系，起限制外来DNA、保护自身DNA的作用 1.I型限制酶属于复合功能酶，兼有修饰和切割DNA两种特性。 功能 核酸内切酶甲基化酶ATP酶DNA解旋酶 特点： 识别和切割位点不一致 没有固定的切割位点 随机切割 不产生特异片段  （1）酶活力单位 限制性内切酶活力单位规定如下：在合适温度、pH值和离子强度等条件下，1小时内完全消化1μg特异DNA底物所需的酶量，定义为一个活力单位。 （2） 星号活性 限制性内切酶在非标准反应条件下，对识别序列的特异性下降，能切割一些与特异识别顺序类似的序列，一般在酶的右上角加*表示。 如克隆过程中需同时进行双酶切，应选用二种酶都能接受的反应缓冲体系（可查阅试剂供应商手册获得），否则可能出现星号活性。 （6）其他注意事项 ： 底物DNA不能含有痕量的酚、氯仿和乙醚 溶液不能含大于10mmol/L的EDTA、SDS和过量的盐 反应缓冲体系中一般加入2-巯基乙醇或二硫苏糖醇防止含巯基酶的氧化失活 加入牛血清白蛋白稳定酶活性 操作时应注意混匀反应体系，这也是常见的酶切失败原因之一 Ⅱ类限制－修饰系统 由两种酶分子组成的二元系统 一种为限制性内切酶，另一种为独立的甲基化酶 这两种酶识别序列相同 如PstⅠ甲基化酶使A甲基化形成5′-CTGCmAG-3′ 大肠杆菌株一般有dam甲基化酶和dcm甲基化酶 甲基化酶的应用 甲基化酶亦是分子克隆的重要工具酶 当制备克隆用双链cDNA时，外源DNA片段可用M.EcoR Ⅰ甲基化酶处理，使双链cDNA内部EcoR Ⅰ位点则因甲基化受到保护而不被切割 三、DNA连接酶 注意：DNA连接酶只能作用于双链DNA分子而不能将二个单链DNA分子连接。 DNA连接酶是重要的基因重组的工具酶 应用DNA连接酶将具有相同粘性末端或平端的DNA分子连接起来。 DNA连接酶的特点： T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶 T4噬菌体DNA连接酶能连接带粘性末端或平末端 的DNA分子 大肠杆菌DNA连接酶不能连接平末端DNA分子 DNA重组技术常用T4噬菌体DNA连接酶 T4噬菌体DNA连接酶连接带粘性末端DNA分子的效率远高于连接平末端的DNA分子 连接反应需要ATP、Mg2+和二硫苏糖醇，最适pH为7.2~7.4，ATP为连接反应提供能量，二硫苏糖醇可提高连接效率 第二节 常用载体 一、质粒载体 1. 质粒载体是应用最广的载体 2. 质粒载体大多是在天然松驰型质粒的基础上经人工改造拼接而成 3. 这类质粒在宿主蛋白质合成及染色体复制停止后尚能继续复制。质粒扩增时，通过加入氯霉素抑制大肠杆菌蛋白质合成，达到进一步提高质粒拷贝数的目的 理想质粒载体应具备特点 1. 松驰型复制子（如ColE1） 复制子（replicon）是质粒自我增殖所必需 2. 几个单一的酶切位点（或多克隆位点） 以便目的DNA片段插入 一、质粒载体 3. 插入失活的筛选标记 一般应具有两种抗菌素抗性标志 如氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因（Tetr）等 4.分子量相对较小和较高的拷贝数 5.缺点：容量较小，一般只能接受小于15kb的DNA （一） pBR322质粒载体 pBR322载体是最早被广泛应用克隆的载体之一，至今尚在使用。 pBR322载体的组成 源于ColE1的派生质粒pMB1的复制起始位点（ori） 来源于pSF2124质粒易位子Tn3的Ampr 来源于pSC101质粒的Tetr pBR322质粒载体和特点 1. 带有一个复制起始点（ori） 2. 抗生素抗性基因（Ampr和Tetr）作选择标记 3. 数个单一的限制性酶切位点 当外源基因插入这些抗性位点时，就分别成为Amp敏感（Amps）或Tet敏感（Tets），即插入失活 一、质粒载体 4. 较小的分子量 易于自身DNA的纯化，而且能有效地克隆6kb大 小的外源DNA片段。 5. 较高的拷贝数 经氯霉素扩增后，每个细胞达1000~3000个拷贝。 一、质粒载体 （二） pUC质粒载体系列 在pBR322基础上改建而成 典型的pU