动物细胞培养基本技术与原理.pptVIP

方法： ①取一定量组织置于小烧杯中，先用BSS漂洗2~3次去掉血污，然后反复剪成0.5~1mm3的小块。 ②加入1~2ml培养液，用吸管轻轻吹打，使组织块悬浮。 ③移入培养瓶，并在瓶壁上吹匀。翻转，使有组织块的瓶壁朝上， 加入培养液，塞紧瓶口，置37℃温箱培养1~2h；待组织牢固贴于瓶 壁，再轻轻翻转，使培养液浸泡组织小块，静止培养。为促进细胞 贴壁，也可先在瓶内壁涂一层血清。 （四）悬浮细胞培养法(suspended cell culture) 利用旋转、振摇或搅拌的方法不让细胞贴壁，使其在培养液中 呈悬浮状态生长。 适用细胞：淋巴细胞、肿瘤细胞、传代细胞系 培养基：合成培养基 ＋ 5~10%血清 ＋ 0.1%甲基纤维素 培养细胞密度：5~7×105cell/ml. 特点：细胞增殖快，产量高，培养过程简单，是动物细胞大规模培 养的理想模式。 （五）微载体培养法(microcarrier culture) 载体：DEAE-交联葡聚糖微粒、DEAE-纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、无机玻璃基质微载体等 微载体培养系统培养细胞步骤： 1、选择合适的微载体类型——获得最大量的细胞，以微载体能全部悬浮在培养液内为最好 2、浸泡水化及消毒 用无Ca2+、Mg2+离子的磷酸缓冲液浸泡3h以上 3、接种（根据细胞类型决定接种浓度） 4、培养观察与细胞计数 5、消化 6、分离细胞或传代培养 （六）多孔载体培养(porosity carrier culture) 优点：增加细胞固定化稳定性，比表面积大，保证细胞充分的生 长空间，细胞生长在载体内部，免受机械损伤。 多孔载体被证明是用于大规模高密度细胞培养的优秀细胞生长 支持物，具有逐步取代传统的实心微载体的趋势。 （七）中空纤维细胞培养法 (hollow fiber cell culture) 模拟细胞在体内生长的三维状态，利用人工的“毛细血管”—— 中空纤维来供给细胞生长的营养等条件 细胞向三维空间生长繁殖，形成类似组织的多层细胞群体，细胞 密度可达109个/ml 。 适用于细胞代谢产物和分泌物的生产。 五、细胞系与克隆株（cell line and clone） 1、细胞系的建立 原代培养的培养物中所含的细胞类型多而复杂，培养初期，生长的 细胞类型多种多样随培养时间延长：一些细胞退化、死亡；另一些 细胞适应环境而生长繁殖培养物逐步变均匀。 传代培养意义：不仅在于维持细胞不断地生长，而且使培养物逐 步演变为具有增殖能力、特征专一、类型均匀的培养细胞，即细胞 系。 细胞系：*指从原代培养物经传代培养后得来的一群特征专一、类 型均匀的细胞，可以长期连续传代。 （1）限定细胞系（有限细胞系） 寿命有限，一般为20~80代 （2）连续培养细胞系（无限细胞系） 细胞发生转化，可连续培养和生长，寿命变为“无限” 2、克隆株（细胞株） 分离单一细胞并使其繁殖形成的细胞群称为细胞株。 单个细胞的生活能力很弱，必须采取特殊的培养措施 适应和同化过程：在细胞接种到新培养液的初期，细胞既从培养液 中摄取营养，也要向培养液排出一定物质，其结果使得培养液更易 被吸收和利用。 适应培养液 制备：选择生长状态良好的对数生长期细胞，无死细胞和碎片，所用细胞的种类应与要克隆的细胞相同。吸出培养液，用G6滤器过滤贮于冰箱中备用。 制备适应性培养基时注意：选用成分齐全的合成培养基，可不加抗生素。 细胞株的制备方法（3种）： （1）集落形成分离法 平皿中接种稀释细胞　　细胞贴壁　　繁殖成许多小群　　选择一个最好的细胞群做标记　　机械法刮除所有其他细胞群　　培养保留下来的细胞群. 克隆成功的关键： ①接种细胞数量要合适、细胞要分散得好。 太多则使细胞操作不便，以每个平皿50~100个细胞为宜。 ②选择细胞克隆时，应逐日观察，能证明被选留的细胞群确系来自于单个细胞。刮除和洗涤一定要彻底。 （2）琼脂分离法（agar Separation） 琼脂培养基的制备： 　 选择质量好的琼脂，用三蒸水配成3%的溶液，分装，灭菌。 培养方法： 向琼脂平皿中接种稀释细胞悬液（适应培养基），培养后，标 记出保留细胞，在显微镜下切下保留细胞处琼脂小块，在BSS中轻 轻漂洗后，用适应培养基继续培养。 （3）多孔塑料板分离法（foamed plastics Separation） 将1ml含有7~8个细胞的悬液接种到多孔无毒塑料板中，每一块板上有数十个圆形小穴。选择仅有单个细胞的小孔观察，待单细胞繁殖成克隆充满小孔后，用胰酶消化分离细胞