胶体金快速免疫诊断技术.pptVIP

Tel:021Tom Bacon, Gene Co.,LTD. Tom Bacon, Gene Co.,LTD 免疫层析快速诊断技术 层析法技术优势:简单\现场\快速 与常规诊断方法相比 技术应用 基本原理是将已知的特异性抗原或抗体固定于硝酸纤维素膜上某一区带作为检测带，在样品区滴加样品后，借助毛细作用，样品泳动至玻璃纤维膜，金标复合物溶解，并与样品进行抗原抗体反应，形成复合物，继续泳动至硝酸纤维素膜的检测区，带有金标记的复合物被检测区抗原或抗体捕获，呈现红色条带。如样品中没有待测抗原或抗体，则不发生结合，即不显色。在硝酸纤维素膜检测区附近一般再固定上针对金标结合物相应的抗原或抗体作为质控带，无论样品中有无待测物，质控线都应显示，如无，则检测失败。整个过程一般在15分钟内完成，操作简单、快速，且不需任何仪器。 免疫层析法检测原理分类介绍 免疫层析法检测原理分类介绍（双抗体夹心） 免疫层析法检测原理分类介绍（竞争反应） 抗体 Antibody 来源差异: 鼠抗,兔抗和羊抗 种类差异: 单抗,多抗 浓度: 浓缩 溶解液:不含盐 容器硅化处理：玻璃表面少量的污染会干扰胶体金 颗粒的生成，一切玻璃容器应绝对清洁，用前经过酸洗、硅化。将玻璃容器浸泡于５％二氯二甲硅烷的氯仿溶液中１分钟，室温干燥后蒸馏水冲洗，再干燥备用 。 1％柠檬酸三钠ml 0.30 0.45 0.70 1.00 1.50 2.00 金溶胶颜色 蓝灰 紫灰 紫红 红 橙红 橙  吸收峰(nm) 220 240 535 525 522 518 径粒(nm) 147 97.5 71.5 40 24.5 15 胶体金的鉴定 1. 肉眼观察：在日光下仔细观察胶体金颜色，可以大致估计金颗粒大小。同时良好的胶体金应该是清澈透明的，若浑浊或有漂浮物提示有较多的凝集颗粒。 2. 分光光度计扫描吸收峰时光波长来估计金颗粒的大小。 3. 电镜可见精确测定金颗粒的大小。 免疫胶体金的制备 胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。蛋白质的预处理:1.蛋白质应先对低离子强度的水透析，去除盐类成份。盐类成份能影响胶体金对蛋白质的吸附，并可使胶体金聚沉，应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在。 2.用微孔滤膜或超速离心除去蛋白质溶液中的细小微粒。 3.胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或略偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。  蛋白质最适用量测定: 将待标记的蛋白质（鼠抗人IgG）储存液作系列稀释后，分别取0.1ml加到 1ml胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质的对照管，5分钟后加入0.1ml 10％NaCl溶液，混匀后静置2小时。 不稳定的金溶胶将发生聚沉，对照管（未加蛋白质）和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作中，可适当增加10％，在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。  胶体金与蛋白质偶联后，加入稳定剂，以避免产生凝集。一般选用PEG（分子量为20000）和牛血清白蛋白作稳定剂。加入的量：5％BSA使溶液终浓度为1%；1%聚乙二醇加至总溶液的1/10。 ①用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl调节金溶胶至所需pH。②于100ml 金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液搅拌2～3分钟。③加入5ml1%PEG20000溶液。④于10000～100000g离心30～60分钟小心吸去上清液（切忌倾倒）。⑤将沉淀悬浮于一定体积含0.2～0.5mg/ml PEG20000的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，浓度以 A540nm=1.5左右为宜，防腐置4℃保存。⑥包被后的金溶胶也可浓缩后于Sephadex G-200柱进行凝胶层析分离纯化，以含 0.1%BSA的缓冲溶液洗脱。通常用IgG包被的金溶胶洗脱液pH为8.2。　　以上操作中应注意，一切溶液中不应含杂质微粒，可用高速离心或微孔滤膜预处理。 胶体金蛋白结合物的质量鉴定 平均直径的