分子生物学实验-Western_blot_实验介绍及流程.ppt

仪 器 培 训 Western blot 实验介绍 及流程 * Bio-rad垂直电泳、电转装置 目的与要求 掌握垂直电泳、电转的基本原理与操作步骤 培训内容 熟悉western-blot 与SDS的基本原理与实验流程 考核题目 * 电泳槽 玻璃板、梳子、加样校准架等 电转移槽 切胶板、黑白夹板、海绵垫等 电泳仪 Bio-rad垂直电泳、电转装置 用途：用于生物学实验中对特定目的蛋白质的分离，定性及定量的检测分析，是Western-blot（蛋白免疫印迹）实验中非常重要的部分。 * Western blot是利用已知的特异性抗体与抗原（即组织细胞中的目的蛋白）能特异性结合的原理，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂（如酶、金属离子、同位素）显示一定的颜色或发光来对组织细胞内目的蛋白定性及半定量的研究。 Western blot 实验原理 抗原 一抗 生物素标记 的二抗 ECL发光试剂 * Western blot 检测蛋白表达实验流程 提取总蛋白 蛋白浓度测定 SDS-聚丙烯 酰胺凝胶电泳 ECL检测 封闭 二抗 一抗 洗涤 洗涤 扫描 分析 转膜 * SDS电泳技术首先在1967年由Shapiro建立,1969年由Weber和Osborn进一步完善。 SDS-聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳，是在PAGE凝胶中引进SDS（十二烷基磺酸钠，含有大量带负电荷的SO32-），SDS能破坏蛋白质分子的二级、三级结构，在含有强还原剂的溶液中可与蛋白质形成SDS-蛋白质复合物（电泳样品加入样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟）。由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了，从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用，蛋白质在SDS胶中的迁移率主要取决于其分子量的大小。  SDS电泳的基本原理 * 1 A protein sample is subjected to electrophoresis on an SDS-polyacrylamide gel. Western blot 实验流程 * SDS电泳操作步骤 （1）配制分离胶 注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速灌胶 （2）灌分离胶 灌胶之上轻轻加一层水或正丁醇液 （3）配制浓缩胶 注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速用滴管灌胶 （4）灌浓缩胶 倒掉分离胶上的水或正丁醇之后，倒置吸净残留溶液，灌注浓缩胶，将梳子插好,胶凝固好后有胶条的国产槽需要去掉胶条（浓缩胶与分离胶一般比例为1：3） （5）加Tris-甘氨酸电泳缓冲液 足量 （6）上样 蛋白质含量要适量，上样总体积要适量 （7）电泳 50V1h, 100V2.5h，根据分子量的大小确定电压和时间，一般溴酚蓝离胶下１cm停止电泳，上槽接负极，下槽接正极 * * 2 Electroblotting transfers the separated proteins from the gel to the surface of a nitrocellulose membrane. Western blot 实验流程 * （1）剥胶 用切胶板切去浓缩胶和多余的分离胶 （2）准备滤纸和硝酸纤维素膜 切滤纸和膜时一定要戴手套，大小与胶一致 （3）浸泡滤纸、膜和海绵垫 用转移液（含甲醇）浸泡，开门通风 （4）制备“三明治” 制备每一层时注意赶气泡 （5）电转 75V，1.5h，在冰浴中进行，黑板对黑极（－），白板对白极（＋） 电转操作步骤 * 4 An antibody that is specific for the protein of interest (the primary antibody - Ab1) is added to the nitrocellulose sheet and reacts with the antigen.? Only the band containing the protein of interest binds the antibody, forming a layer of antibody molecules Western blot 实验流程 一抗孵育：必须选择可以抗抗原种属的一抗。如做大鼠目的蛋白的检测，则我们选择的一抗可以是来自兔、人、小鼠的抗大鼠的抗体。一抗浓度及孵育时间、温度很重要。 3 Th